唐天豪, 張瑩**, 呂宗偉, 胡玉香, 黃平, 張玉, 潘寧波

(1.貴州省人民醫(yī)院 肝膽外科, 貴州 貴陽 550002; 2.貴州省人民醫(yī)院 病理科, 貴州 貴陽 550002; 3.貴州省人民醫(yī)院 信息科, 貴州 貴陽 550002; 4.廣元市第一人名醫(yī)院 胃腸外科, 四川 廣元 628040)

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperdusion injury,HIRI)是肝臟在遭受嚴(yán)重的缺血缺氧打擊后導(dǎo)致肝功能恢復(fù)遲緩的并發(fā)癥,是臨床工作中亟待解決的問題。線粒體的結(jié)構(gòu)功能損傷是HIRI的核心問題,而逆轉(zhuǎn)線粒體損傷可有效減輕HIRI［1-3］。轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)是一種能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、自噬和溶酶體等細(xì)胞活動的特殊蛋白,其轉(zhuǎn)錄活性受雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)介導(dǎo)的磷酸化機制調(diào)控,特異性抑制mTORC1作用的靶點,可減少TFEB磷酸化的發(fā)生、從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性［4-5］。近期研究發(fā)現(xiàn),TFEB信號通路在急性腎損傷［6］、心?。?］和腦［8］缺血再灌注損傷中均具有保護作用,同時TFEB還在細(xì)胞內(nèi)通過維持線粒體自噬和生物發(fā)生之間的平衡以調(diào)控線粒體變化［9］,而此通路在HIRI中研究甚少,本研究初步分析mTORC1-TFEB信號通路在HIRI中對線粒體的影響及意義,以期為HIRI防治提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 36只雄性無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級Sprague Dawley(SD)大鼠,體質(zhì)量(240±10)g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,合格證號SCXK(遼)-2020-0001,研究獲貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號20210094);大鼠自由飲食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.1.2主要試劑及儀器 谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,磷酸化mTORC1(p-mTORC1)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司,TFEB一抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購自北京索萊寶科技有限公司。引物設(shè)計合成購自上海生工生物工程股份有限公司,RNA提取試劑盒購自北京天漠科技開發(fā)有限公司,SYBRTM Green PCR試劑盒和High Capacity cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。CFX96熒光定量PCR儀、C1000 Thermal Cycler、ChemiDocTMTouch Imaging System凝膠成像分析系統(tǒng)來自美國Bio-Rad公司,JEM-1400PLUS透射電子顯微鏡來自日本JEOL公司,UCT-RT超薄切片機來自德國Leica公司,Multiskan GO 1510酶標(biāo)儀來自美國Thermo Fisher Scientific公司,1580R型高速低溫冷凍離心機來自丹麥Labogene公司,多功能電泳系統(tǒng)來自美國Hoefer公司。

1.2 動物分組及造模

36只SD雄性大鼠,隨機均分為對照組、模型組及藥物組,對照組和模型組大鼠術(shù)前持續(xù)3 d腹腔注射0.9%NaCl溶液(2.0 mL/kg·d),藥物組大鼠術(shù)前持續(xù)3 d腹腔注射雷帕霉素溶液(2.0 mL/kg·d);各組大鼠禁食1 d后,2%戊巴比妥鈉腔內(nèi)注射麻醉,取腹部正中切口,逐層進(jìn)入腹腔并解剖出第一肝門,模型組和藥物組大鼠以無創(chuàng)血管夾夾閉第一肝門、使肝臟完全缺血30 min后取出血管夾,對照組大鼠不夾閉第一肝門,各組大鼠間斷縫合關(guān)閉腹腔、置于清潔干燥鼠籠待蘇醒。分別于術(shù)后24 h、72 h兩個時間點每組隨機取6只大鼠肝臟組織用于后續(xù)實驗。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1肝組織形態(tài)學(xué)特征 取固定在10%中性福爾馬林的肝臟組織,常規(guī)制成石蠟切片、HE染色,于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織學(xué)特征,參照組織學(xué)活性指數(shù)［10］對肝臟組織結(jié)果進(jìn)行計分,計分項包括壞死性炎癥計分、結(jié)構(gòu)改變、纖維化和肝硬化。

1.3.2透射電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu) 取大鼠肝臟組織切成約1 mm3的組織塊,固定于1%餓酸中,梯度乙醇脫水、環(huán)氧樹脂包埋后超薄切片、枸椽酸鉛及醋酸鈾雙重染色后,嵌入環(huán)氧樹脂,于8 000倍透射電鏡下觀察肝細(xì)胞內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。

1.3.3檢測AST及ALT 取部分肝臟組織,按照重量∶體積(g∶mL)=1∶9的比例加入PBS液,充分研磨勻漿、離心,取上清液按照比色法說明書測定谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度。

1.3.4蛋白印跡實驗(Western Blot)檢測肝臟組織p-mTORC1、TFEB蛋白的表達(dá) 取肝臟組織100 mg研磨、裂解、勻漿后測定蛋白濃度;制備電泳上樣樣品,取50 μg蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入一抗p-mTORC1(1∶1 000)、TFEB(1∶1 000)孵育過夜,洗凈后加入二抗孵育,再次洗凈后采用增強化學(xué)發(fā)光法顯色,通過Image lab 5.0凝膠成像系統(tǒng)軟件分析目標(biāo)帶的灰度值。

1.3.5實時熒光PCR(RT-PCR)檢測肝臟組織p-mTORC1、TFEB mRNA表達(dá) 取肝臟組織30 mg提取總mRNA,測定總濃度,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA產(chǎn)物作為模板,配置反應(yīng)體系:qPCR預(yù)混液10 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA 1 μL、滅菌水7.0 μL。PCR擴增模式:94 ℃ 10 min,(94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s)40個循環(huán),以GAPDH蛋白為參照,利用2-ΔΔCT分析相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄情況。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝組織形態(tài)學(xué)特征

術(shù)后24 h,對照組大鼠肝臟組織形態(tài)表現(xiàn)正常、結(jié)構(gòu)完整,組織學(xué)活性指數(shù)總計分為0分;模型組大鼠肝臟組織中央靜脈明顯充血,肝小葉結(jié)構(gòu)異常紊亂,肝細(xì)胞出現(xiàn)大量水腫、空泡樣變性甚至壞死,組織學(xué)活性指數(shù)總計分顯著升高;藥物組肝臟組織細(xì)胞損傷程度較模型組輕,且組織學(xué)活性指數(shù)總計分較模型組降低(P<0.05)。術(shù)后72 h,對照組較術(shù)后24 h無明顯變化,組織學(xué)活性指數(shù)總計分無變化(P>0.05);模型組及藥物組肝臟損傷程度相對同組術(shù)后24 h減輕(P<0.05),組織學(xué)活性指數(shù)總計分較模型組均降低,且藥物組減輕程度明顯優(yōu)于模型組(P<0.05)。見表2和圖1。

圖1 術(shù)后24及72 h時各組大鼠肝臟組織學(xué)(HE,×400)

表2 術(shù)后24 及72 h時各組大鼠肝臟組織學(xué)活性指數(shù)

2.2 肝細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)

術(shù)后24 h,對照組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)正常,大小居中,多呈圓或橢圓形狀,內(nèi)部嵴飽滿,膜結(jié)構(gòu)完整;模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹變形甚至破裂,內(nèi)部嵴斷裂嚴(yán)重,內(nèi)外雙層膜結(jié)構(gòu)破損;藥物組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷程度較模型組明顯減輕。術(shù)后72 h,對照組大鼠肝細(xì)胞相對術(shù)后24 h無明顯變化;模型組及藥物組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)線粒體破壞程度相對同組術(shù)后24 h時減輕,且藥物組線粒體損傷減輕程度明顯優(yōu)于模型組。見圖2。

注：紅色箭頭所示形態(tài)正常的線粒體,黃色箭頭所示結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重的線粒體,綠色箭頭所示結(jié)構(gòu)受損較輕的線粒體,藍(lán)色箭頭所示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

2.3 肝臟組織AST、ALT水平

術(shù)后24 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟的AST、ALT表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟的AST、ALT表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后72 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟AST、ALT表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟AST、ALT表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與同組術(shù)后24 h比較,術(shù)后72 h模型組及藥物組大鼠肝臟AST、ALT表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 術(shù)后24 及72 h時各組大鼠肝臟組織AST及ALT水平

2.4 肝臟組織p-mTORC1、TFEB蛋白的表達(dá)

術(shù)后24 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟組織p-mTORC1蛋白表達(dá)水平降低而TFEB 蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟的p-mTORC1 蛋白表達(dá)水平降低而TFEB蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后72 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟的p-mTORC1蛋白表達(dá)水平降低而TFEB蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 蛋白表達(dá)水平降低而TFEB蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與同組術(shù)后24 h比較,術(shù)后72 h模型組及藥物組大鼠肝臟p-mTORC1蛋白表達(dá)水平升高而TFEB蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4和圖3。

圖3 術(shù)后24及72 h時各組大鼠肝臟組織p-mTORC1和TFEB蛋白表達(dá)

表4 術(shù)后24及72 h時各組大鼠肝臟組織p-mTORC1、TFEB蛋白表達(dá)

2.5 肝臟組織p-mTORC1、TFEB mRNA表達(dá)

術(shù)后24 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 mRNA表達(dá)水平降低、TFEB mRNA表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 mRNA表達(dá)水平降低、TFEB mRNA表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后72 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 mRNA表達(dá)水平降低、TFEB mRNA表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 mRNA表達(dá)水平降低、TFEB mRNA表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與同組術(shù)后24 h比較,術(shù)后72 h模型組及藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 mRNA表達(dá)水平升高、TFEB mRNA表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 術(shù)后24及72 h時各組大鼠肝臟組織p-mTORC1、TFEB mRNA表達(dá)

3 討論

HIRI是指肝臟血供在一定時間內(nèi)被完全中斷,血流急速恢復(fù)供應(yīng)后肝功能卻不能及時恢復(fù),甚至?xí)^續(xù)增加肝臟結(jié)構(gòu)和功能的破壞程度,進(jìn)一步誘發(fā)多種肝臟并發(fā)癥。HIRI常發(fā)生于腫瘤切除術(shù)、肝臟移植術(shù)以及重度休克等治療期間,嚴(yán)重影響患者術(shù)后恢復(fù)質(zhì)量。而HIRI發(fā)生機制仍不明確,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體結(jié)構(gòu)功能受損、細(xì)胞程序性死亡以及炎癥反應(yīng)等相關(guān)［11-13］,其中線粒體結(jié)構(gòu)功能的變化在HIRI中更為舉足輕重［14］。

肝臟是人體內(nèi)能量代謝的中樞,是各種生命活動代謝的重要場所,其細(xì)胞內(nèi)富含大量的線粒體,能夠為細(xì)胞生命活動提供足夠的能量補給,因此肝臟線粒體結(jié)構(gòu)功能改變在HIRI中的作用成為近期研究熱點［15-17］,同時相關(guān)實驗也發(fā)現(xiàn)在HIRI中肝臟損傷的程度與線粒體損傷程度呈正相關(guān)［18］,抑制線粒體損傷、促進(jìn)線粒體恢復(fù)有助于降低HIRI。TFEB作為人類小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)家族中的一員,在參與調(diào)節(jié)自噬和溶酶體生物發(fā)生的同時,TFEB也在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著尤其重要的作用［19］。因此有理由推測mTORC1-TFEB信號通路在HIRI中對線粒體有一定影響作用,可通過改善線粒體損傷減輕HIRI。

mTORC1是一組對雷帕霉素敏感的特殊蛋白,主要由Raptor、mLST8和mTOR結(jié)合而成,能密切調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育、細(xì)胞自噬以及能量代謝［20］,其磷酸化機制作用Ser211調(diào)控TFEB的亞細(xì)胞定位和活性,可導(dǎo)致磷酸化狀態(tài)的TFEB與細(xì)胞質(zhì)伴侶的酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶活化蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,YWHAZ/14-3-3)結(jié)合后停留在細(xì)胞質(zhì)中失去生物活性;而抑制mTORC1的活性后可促進(jìn)TFEB發(fā)生去磷酸化進(jìn)行核轉(zhuǎn)移,與細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控原件結(jié)合參與細(xì)胞多個生物反應(yīng)［9,21］。自噬是將被標(biāo)記的細(xì)胞質(zhì)相關(guān)成分送至溶酶體進(jìn)行生物降解和成分回收利用的一種細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制,可大致分為巨自噬、微自噬以及伴侶自噬［22］,而線粒體自噬作為微自噬中的一種形式,以被標(biāo)記的受損線粒體為主要目標(biāo)進(jìn)行識別、融合及降解,對于維持線粒體質(zhì)量尤其重要［23］。當(dāng)線粒體在細(xì)胞內(nèi)遭受嚴(yán)重打擊時,內(nèi)膜發(fā)生變化通透性增加,啟動經(jīng)典的PINK1/Parkin線粒體自噬途徑來清除受損嚴(yán)重的線粒體。TFEB作為自噬通路的關(guān)鍵因子,可以通過上調(diào)自噬通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平參與線粒體自噬,從而吞噬受損的線粒體［6］,并且TFEB的過表達(dá)還可以減少線粒體損傷進(jìn)一步累積,達(dá)到減輕線粒體損傷的目的［24］。因此在本研究中,再灌注早期(24 h)時,模型組TFEB正?；罨^程受阻,導(dǎo)致線粒體損傷累積過重?zé)o法被及時清除,在電鏡下觀察到的線粒體腫脹破壞嚴(yán)重,形態(tài)結(jié)構(gòu)不復(fù)存在,殘存的正常線粒體為數(shù)不多,肝臟組織破壞嚴(yán)重且肝功能明顯受損;藥物組在特異性抑制劑雷帕霉素的預(yù)處理下,p-mTORC1蛋白和mRNA的表達(dá)較模型組明顯降低,而TFEB蛋白和mRNA的表達(dá)較模型組顯著升高,TFEB過表達(dá)后啟動生物反應(yīng),損傷嚴(yán)重的線粒體能夠及時被清除,因此電鏡下觀察到的線粒體破壞程度較模型組顯著減輕,尚未完全損壞,膜結(jié)構(gòu)相對完整,而且肝臟組織結(jié)構(gòu)、功能損傷程度明顯減輕,肝細(xì)胞變性、壞死以及肝組織中AST、ALT表達(dá)水平較模型組明顯下降。TFEB不僅通過上調(diào)自噬活性減輕線粒體損傷的積累,同時還可以誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生,從而減輕線粒體損傷并促進(jìn)線粒體恢復(fù)［25］。再灌注晚期(72 h)時,藥物組TFEB的相關(guān)表達(dá)仍處于一個高水平狀態(tài),線粒體形態(tài)恢復(fù)效果明顯優(yōu)于模型組,AST、ALT表達(dá)水平下降明顯,肝臟恢復(fù)程度也明顯優(yōu)于模型組,提示促進(jìn)線粒體恢復(fù),可降低HIRI,促進(jìn)肝功能恢復(fù)。

綜上所述,mTORC1-TFEB信號通路激活后通過減輕線粒體損傷、促進(jìn)線粒體恢復(fù),從而改善肝功能、降低肝臟缺血再灌注損傷程度。