王萍，陳麗艷，孫銀玲，蒙艷麗，王欣，王偉明

黑龍江省中醫(yī)藥科學院（哈爾濱 150036）

氣虛血瘀是諸如冠心病、肺心病、高血壓病、糖尿病、腦卒中、缺血性中風等多種疾病的重要病理基礎，是疾病進展的某個階段癥狀綜合性的表現(xiàn)，也是老年認知功能障礙的主要病機之一?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，氣虛血瘀證患者血液流變學呈黏聚傾向，微循環(huán)障礙，凝血功能亢進，纖溶活性降低等[1-5]。《醫(yī)林改錯》中記載的補陽還五湯為針對氣虛血瘀證的主要益氣活血方劑，以黃芪為君補氣且能固攝經(jīng)絡之氣，當歸為臣，佐以赤芍，川芎，桃仁，紅花活血祛瘀，地龍通經(jīng)活絡。而黃芪具有補氣升陽、托毒排膿、斂瘡生肌、利水消腫、固表止汗的功效，與大豆共發(fā)酵提高了纖溶酶活性，同時又兼具黃芪的補氣作用，共同增強并發(fā)揮“益氣活血”作用[1,6-8]。因此，此次試驗通過研究黃芪豆豉對氣虛血瘀模型大鼠的血液流變學的影響，探討其益氣活血作用及其機制，為黃芪豆豉的應用提供參考。

1 材料

1.1 試驗動物

清潔級Wistar大鼠（哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部），70只，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，許可證號：SCXK（黑）2019-001。

1.2 試驗藥物

采用前期課題組研究黃芪豆豉發(fā)酵的最優(yōu)工藝，稱取黃芪，加10倍量的水煎煮2次，每次1 h，合并濾液，制成的黃芪提取液質(zhì)量濃度為75 mg/mL（依據(jù)藥典用量），以75 mg/mL的黃芪提取液按照1∶1（mL/g）浸泡大豆，待大豆吸盡溶液，裝袋，于121 ℃滅菌40 min，接種DCT-1菌液[9]（108CFU/mL，2%），于37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h制備黃芪豆豉，備用，其中黃芪豆豉和豆豉組因考慮酶活性加入生理鹽水利用勻漿機進行勻漿；補陽還五湯經(jīng)過煎煮濃縮后均制備成2 g/mL生藥量的母液保存，備用，用時用生理鹽水配制成所需濃度[10-11]。

1.3 儀器

DL-CJ-2N凈化工作臺（北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司）；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技儀器有限公司）；Tecan infinite M200 PRO Nano Quant多功能酶標儀[帝肯（上海）貿(mào)易有限公司]；Legend micro 17R冷凍高速離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；GEN Ⅲ MicroStation自動微生物鑒定系統(tǒng)（美國 BIOLOG公司）；LBY-N6B型血液黏度儀（北京普利生儀器有限公司）；LBY-BX型紅細胞變形儀（北京普利生儀器有限公司）；LBY-NJ型血小板聚集儀（北京普利生儀器有限公司）。

1.4 試劑

血栓素（TXB2，上海生工生物股份有限公司，批號：20190823）；6-酮-前列腺素PGF1α（南京建成生物工程研究所，批號：20190820）；氯化鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20190108）；DCT-1菌株（前期課題組分離自淡豆豉飲片）；黃豆（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院，2017年種植采收）；黃芪{亳州市張仲景中藥飲片有限責任公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學院王偉明研究員鑒定為豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membrannceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）]}；Hsiao的干燥根、補陽還五湯（購自黑龍江哈爾濱海輝連鎖藥店）。

2 方法

2.1 動物分組、模型構(gòu)建及給藥方法

在中醫(yī)理論指導下，復合因素誘導氣虛血瘀動物模型比較多樣。王賢成等[12]采用“力竭游泳+皮下注射腎上腺素”復制氣虛血瘀大鼠模型；龐樹玲等[13]采用“饑餓+寒涼+疲勞游泳”復制氣虛血瘀大鼠模型；胡建鵬等[14]采用“饑餓+勞累+高脂飲食+結(jié)扎左側(cè)總動脈”復制大鼠缺血性中風氣虛血瘀證模型。此研究采用“饑餓+寒涼+力竭游泳”方法建立氣虛血瘀大鼠模型，具有造模方法穩(wěn)定、與臨床病癥結(jié)合度高等優(yōu)點[5]。

大鼠常規(guī)喂養(yǎng)3 d后，進行隨機分組，每組10只，分為空白組、模型組、黃芪豆豉高劑量組（6 g/kg）、黃芪豆豉中劑量組（3 g/kg）、黃芪豆豉低劑量組（1.5 g/kg）、豆豉組及補陽還五湯組（陽對藥組）。

空白組：采用常規(guī)飼養(yǎng)，充足食水。

造模組及各給藥組：試驗過程中各組每天進行力竭游泳試驗，將大鼠置于水深35±5 cm，水溫15±2℃，直徑90 cm的水桶中進行游泳，以每組大鼠自然沉降沒入水中3～5 s不能自主上浮為其疲憊標準。當全組有50%出現(xiàn)自然沉降時，全組停止游泳撈出，使之暴露于空氣中自然晾干，連續(xù)造模60 d。每日力竭游泳后各組給予正常飲食量的1/2飼養(yǎng)，每天每只大鼠按照40 g/kg喂養(yǎng)。

此研究采用造模與給藥同時進行的方式，給藥組采用灌胃給藥，空白組和模型組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)造模給藥60 d。

2.2 血液流變學指標及相關(guān)因子分析

2.2.1 血清樣品的處理方法

造模給藥60 d后，從各組大鼠經(jīng)腹主動脈取血，室溫靜置1 h，按3 000 r/min離心10 min，仔細收集上清，保存于-20 ℃冰箱中備用。

2.2.2 血液流變學相關(guān)指標檢測[5,15]

取4 mL肝素鈉抗凝血，采用全自動血液流變儀，設置為高、中和低三個切變率，進行全血黏度測定。

取2 mL枸櫞酸鈉抗凝血，在3 000 r/min高速離心10 min，取上層血漿，進行血漿黏度測定，儀器同上。

取2 mL EDTA-K2抗凝血，進行紅細胞聚集指數(shù)測定，儀器同上。

采用酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）測定大鼠血清中血栓素B2和6-酮前列腺素PGF1α（6-keto-PGF1α）的含量[16]。按照試劑盒所提供說明書進行操作及檢測，根據(jù)標準品的濃度以及對應的吸光度（A）計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的吸光度（A）計算出對應的樣品濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 血流變學指標

由表1，表2及圖1～圖4可得：與空白組相比，模型組的全血低、中、高切差異極顯著（**P＜0.01），全血相對指數(shù)低切、高切差異極顯著（**P＜0.01），說明模型組造模很成功；與模型組相比，空白組的全血高、中、低切，黃芪豆豉低劑量組的低切、高切，黃芪豆豉中劑量組的低切、高切，黃芪豆豉高劑量組的低切、高切差異極顯著（##P＜0.01）；空白組、黃芪豆豉低劑量組和中劑量組的全血相對指數(shù)低切、高切及黃芪豆豉高劑量組的低切差異極顯著（##P＜0.01）；而血漿黏度和紅細胞聚集指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），表明黃芪豆豉可以降低氣虛血瘀模型大鼠全血黏度，緩解“黏”“稠”的特征，從而改善血瘀證，體現(xiàn)出活血作用。

圖1 大鼠全血黏度柱狀圖

圖2 大鼠全血相對指數(shù)柱狀圖

圖3 大鼠全血相對指數(shù)柱狀圖

圖4 大鼠全血相對指數(shù)柱狀圖

表1 各組大鼠全血黏度指標

表2 各組大鼠全血相對指數(shù)和紅細胞聚集指數(shù)的影響

3.2 大鼠全血相對指數(shù)和紅細胞聚集指數(shù)

3.3 各組大鼠血液中血栓素B2/6-酮前列腺素-PGF1α對比分析

結(jié)果如圖5～圖7所示，模型組大鼠血栓素B2含量為12.89 ng/L，6-酮前列腺素-PGF1α含量為1 302.75 ng/L，血栓素B2和6-酮前列腺素-PGF1α的比值為0.009 9，黃芪豆豉高、中、低劑量組大鼠血栓素B2含量分別為7.29，6.04和8.83 ng/L，6-酮前列腺素-PGF1α含量分別為2 079.51，2 039.93和1 880.74 ng/L，血栓素B2和6-酮前列腺素-PGF1α的比值分別為0.003 5，0.002 9和0.004 6，可見黃芪豆豉高、中、低劑量組TXB2/6-keto-PGF1α濃度相對于模型組明顯減低并趨近于空白組，其中黃芪豆豉中劑量組最接近空白組水平，表明適當劑量的黃芪豆豉能降低血小板聚集性和血液黏度，從而減輕“血瘀證”，具有活血作用。

圖5 各組大鼠血液中TXB2的含量

圖6 各組大鼠血液中6-keto-PGF1α的含量

圖7 各組大鼠血液中TXB2/6-keto-PGF1α的比值

4 討論與結(jié)論

以氣虛血瘀的中醫(yī)指導理論為基礎，通過對試驗動物采用冷水力竭游泳+限食飼養(yǎng)饑餓+力竭疲勞游泳的復合因素方法成功復制氣虛血瘀大鼠模型。造模方法和指標檢測均比較符合氣虛血瘀癥狀，模型組大鼠因長期力竭和饑餓的條件下，氣血不足，身體調(diào)養(yǎng)欠缺，使其體重增長緩慢，毛發(fā)凌亂無光澤，耳部、爪部及尾部發(fā)白無血色，精神萎靡。從證型角度造模更符合中醫(yī)理論，較化學藥物造模更適用于中藥的藥理學研究。

對氣虛血瘀證模型大鼠的血液流變學指標進行檢測有重要的意義，全血黏度表示血液總體（包含血細胞和血漿）流動性的指標。全血黏度增高表示血液黏滯性增加而流動性降低。由于血液在不同的流動狀態(tài)（切變速度）下所表現(xiàn)的黏度是不同的，因而一般測定由高到低幾種不同切變速度下的全血黏度，用以大致反映血液在體內(nèi)不同粗細、不同壓差的血管中的流動性。血漿黏度增加的直接原因是血漿纖維蛋白原或大分子球蛋白增加，或血脂顯著增加。全血相對指數(shù)是指除去血漿黏度這個影響因素后的全血黏度，它反映血細胞濃度和血細胞本身性質(zhì)對血液流動性的影響，它也有兩個指標：（1）全血高切相對黏度，其增加的直接原因是血細胞濃度增加，或紅細胞剛性增高（變形能力降低）；（2）全血低切相對黏度，其增加的直接原因是血細胞濃度增加，或紅細胞聚集性增加。

TXB2是TXA2的產(chǎn)物，而TXA2是前列腺素的一種，是由血小板產(chǎn)生的具有血小板凝聚及血管收縮的作用的生物活性物質(zhì)，其半衰期只有30 s，產(chǎn)生后會迅速轉(zhuǎn)化為無活性的TXB2[17]。6-keto-PGF1α是PGI2的代謝產(chǎn)物，而PGI2是由血管內(nèi)皮細胞合成后釋放出的抗血小板聚集和舒張血管的一種生物活性物質(zhì)，同樣地，PGI2半衰期很短，會迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定無活性的6-keto-PGF1α。TXA2/PGI2比值高易導致血小板聚集，血栓形成，促進動脈硬化和冠心病[18]。而通過檢測穩(wěn)定物質(zhì)TXB2和6-keto-PGF1α的比值水平就可以間接了解TXA2和PGI2的水平。

造模給藥60 d后取材時，模型組大鼠腹主動脈血液明顯較其他組黏稠且已凝固，從表征指標上看，黃芪豆豉高、中劑量組優(yōu)于模型組氣虛血瘀大鼠，從血液流變學指標上看，黃芪豆豉高、中劑量組的數(shù)據(jù)均證明服用黃芪豆豉可以明顯改善氣虛血瘀大鼠的血液黏度，表明了黃芪豆豉具有益氣活血作用。