劉桂鳳，丁銀平，周志強(qiáng)，鄭盈瑩，任琦

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingiiHu 干燥果實(shí)，主要分布在江西、福建、浙江等地，用于陽(yáng)痿早泄、目暗昏花等病癥［1］。覆盆子的質(zhì)量評(píng)價(jià)目前主要側(cè)重于鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷等活性成分的含量測(cè)定研究［2-6］，難以評(píng)價(jià)其整體質(zhì)量。中藥指紋圖譜可宏觀反映中藥化學(xué)信息，具有整體性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)［7-8］，是當(dāng)今公認(rèn)的中藥質(zhì)量控制模式，在評(píng)價(jià)中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣和確保藥材一致穩(wěn)定方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。關(guān)于覆盆子指紋圖譜的研究目前已有少數(shù)報(bào)道［9-11］，但未見(jiàn)對(duì)不同產(chǎn)地藥材粉末的研究。由于覆盆子分布區(qū)域較廣，各產(chǎn)地質(zhì)量不一，因此采用指紋圖譜評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地覆盆子質(zhì)量很有必要。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法，以6 號(hào)峰（鞣花酸）為參照，建立不同產(chǎn)地覆盆子的指紋圖譜，為其質(zhì)量控制與資源開(kāi)發(fā)提供一定參考。

1 儀器與試藥

UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；KQ-500DE 數(shù)控型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋［國(guó)華（常州）電器公司］；梅特勒ML204 型電子天平（梅特勒托利多公司）；Secura 126-1CN 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。椴樹苷對(duì)照品（批號(hào)112000-201501，含量以100%計(jì)），山柰酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品（批號(hào)121007-201602，含量以90.8%計(jì)），鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)111959-201903，含量以88.3%計(jì)），蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-201811，含量以91.6%計(jì)），槲皮素對(duì)照品（批號(hào)100081-201610，含量以99.1%計(jì)），山柰素（山柰酚）對(duì)照品（批號(hào)110861-201812，含量以93.8%計(jì)），以上對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。色譜甲醇和色譜乙腈（sigma 公司）、色譜磷酸（上海麥克林試劑公司）、水為Milli-Q 制備的超純水。覆盆子藥材于2022 年5 月收集于樟樹藥材市場(chǎng)及藥農(nóng)手中，經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院中藥室主管中藥師丁銀平鑒定為華東覆盆子Rubus chingiiHu，具體樣品信息見(jiàn)表1。

表1 覆盆子樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1混合對(duì)照溶液的制備分別精密稱取山柰酚-3-O-蕓香糖苷、椴樹苷、鞣花酸、蘆丁、槲皮素、山柰素對(duì)照品適量，加甲醇使溶解制成每1 mL 含山柰酚-3-O-蕓香糖苷10 μg、椴樹苷10 μg、鞣花酸20 μg、蘆丁10 μg、槲皮素10 μg、山柰素10 μg 的混合對(duì)照溶液。

2.1.2供試品溶液的制備精密稱取覆盆子粉末（過(guò)二號(hào)篩）約0.5 g，置錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent 5TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，85% A；8～23 min，85%→67% A；23～39 min，67%→58% A；39～45 min，58%→72%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.3 精密度試驗(yàn)

取覆盆子藥材（批號(hào)：YL220530059）粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.2”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，以鞣花酸峰為參照，記錄色譜圖。結(jié)果13 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.1%,相對(duì)峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取覆盆子藥材（批號(hào)：YL220530059）粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0 h、3 h、7 h、11 h、16 h、24 h，照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以鞣花酸峰為參照，記錄色譜圖。結(jié)果13 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.2%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取覆盆子藥材（批號(hào)：YL220530059）粉末6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以鞣花酸峰為參照，記錄色譜圖。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.1%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.6 指紋圖譜的建立與分析

取9 批覆盆子藥材照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制樣，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，得到覆盆子指紋圖譜，如圖1所示。將覆盆子指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，生成對(duì)照?qǐng)D譜，如圖2。覆盆子指紋圖譜共標(biāo)定13 個(gè)共有色譜峰。13 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積見(jiàn)表2、表3。

圖1 9 批覆盆子疊加指紋圖譜

圖2 覆盆子對(duì)照指紋圖譜

表2 覆盆子藥材共有峰的相對(duì)保留時(shí)間 min

表3 覆盆子藥材共有峰的相對(duì)峰面積

2.6.1峰的確認(rèn)經(jīng)與對(duì)照品溶液的保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖對(duì)比，指認(rèn)出6 個(gè)成分，分別是蘆丁（5 號(hào)峰）、鞣花酸（6 號(hào)峰）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（8 號(hào)峰）、椴樹苷（11 號(hào)峰）、槲皮素（12號(hào)峰）、山柰素（13 號(hào)峰）?；旌蠈?duì)照品圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 混合對(duì)照品圖譜

2.6.2不同產(chǎn)地覆盆子相似度結(jié)果計(jì)算9 批覆盆子樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)表4。9 批樣品相似度計(jì)算結(jié)果在0.933～0.992，不同產(chǎn)地覆盆子藥材化學(xué)成分基本一致。

表4 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6.3不同產(chǎn)地覆盆子聚類分析結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)9 批覆盆子藥材相對(duì)峰面積進(jìn)行聚類分析（between-groups linkage，平方euclidian 距離），結(jié)果見(jiàn)圖4。根據(jù)樹狀圖結(jié)果可知9 批樣品大體聚為2 類，1、2、3 為一類；4、5、6、7、8、9 為一類。結(jié)合樣品產(chǎn)地看，前者樣品來(lái)源于浙江，后者樣品采自于江西，與聚類分析結(jié)果相一致。表明樣品化學(xué)成分的相對(duì)含量受產(chǎn)地影響。

圖4 聚類分析結(jié)果

3 討論

本研究考察了254 nm、316 nm、344 nm、360 nm四個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)在360 nm 處樣品色譜信息豐富，基線穩(wěn)定，各色譜峰分離度較好且具有較好的紫外吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)定為360 nm。同時(shí)考察了Intersil ODS-SP（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱和依利特C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱，在同一色譜條件下使用三種色譜柱對(duì)同一樣品進(jìn)行分析，結(jié)果色譜峰峰形良好，表明不同品牌色譜柱對(duì)色譜峰影響不大。

覆盆子主要的活性成分為黃酮類化合物。本研究采用甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇作提取溶劑。以甲醇和70%甲醇提取的色譜峰峰面積較大，考慮到節(jié)能環(huán)保，選擇70%甲醇作提取溶劑。同時(shí)比較超聲1 h 和回流1 h，發(fā)現(xiàn)加熱回流的樣品色譜信號(hào)峰較多，故本實(shí)驗(yàn)采用加熱回流1 h 的提取方法。

本研究采用HPLC 法建立了不同產(chǎn)地覆盆子藥材的指紋圖譜，該方法具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性；9 批覆盆子指紋圖譜相似度均大于0.9，表明不同產(chǎn)地的覆盆子活性成分具有相似性，整體質(zhì)量一致；但每個(gè)共有色譜峰的相對(duì)峰面積受產(chǎn)地環(huán)境影響而相對(duì)含量不同。樣品化學(xué)成分的相對(duì)含量不僅受產(chǎn)地影響，還與樣品采集時(shí)間、加工方式、儲(chǔ)存條件及儲(chǔ)存時(shí)間有關(guān)［12-13］。本研究建立的指紋圖譜方法穩(wěn)定，可為覆盆子藥材的資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量控制提供參考。