◎ 薛壹帆，楊 磊，胡家瑋，陳 貝，周 威,2

（1.武漢輕工大學 醫(yī)學與健康學院，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)研究院，湖北 武漢 430023）

糖尿病是目前世界高發(fā)病之一，是一種常見的代謝性疾病，是由遺傳基因、免疫功能紊亂等多種病因引起的，以高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合征[1]。隨著人們生活水平的提高和生活方式的變化，糖尿病的患病率不斷提升，人們對天然藥食同源性食物輔助治療及控制糖尿病及其并發(fā)癥的需求不斷增多。

三白花茶（代用茶）是干魚腥草提取物與綠茶粉末的混合物，屬于武漢康達爾生物科技有限公司代用茶產(chǎn)品；其中魚腥草為三白草科植物蕺菜的干燥地上部分，屬于《中國藥典》收錄的中藥材，并屬于國家衛(wèi)健委規(guī)定的藥食同源類中藥來源。已有資料顯示，魚腥草、綠茶均有輔助降低血糖、抗炎、降低糖尿病多種并發(fā)癥發(fā)病率及程度的作用[2-5]。在現(xiàn)有三白花代用茶的制備工藝中，是采用干品魚腥草提取物與綠茶進行混合制粒。本次研究依照三白花產(chǎn)品的配方，采用與配方表中劑量一致的干、鮮魚腥草提取物與綠茶混合制成兩種制劑，以空腹血糖值、血清胰島素值、α-葡萄糖苷酶體外抑制率、α-淀粉酶體外抑制率為指標，研究兩種制劑對糖尿病模型小鼠的作用及可能機制，并比較兩種制劑的相應效應。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥品與試劑

DFT-200 手提式中藥粉碎機，江陰市洲元藥化機械制造有限公司；Aquaprince AJC-0501-P 純水機；美國Bio Tech EPOCH 全波長酶標儀；Eppendorf Centrifuge 5702 高速冷凍離心機；TGL-16C 高速離心機，上海安亭科學儀器廠；金葉SHZ-Ⅲ型真空泵，上海亞榮生化儀器廠；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；KH3200DB 超聲波振蕩器，江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；JY6001 型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；安穩(wěn)免條碼型三諾血糖儀及血糖試紙，湖南三諾。

三白花茶（含干魚腥草提取物）、鮮魚腥草提取物與綠茶混合中試樣品均由武漢康達爾生物科技有限公司檢測合格并提供，其中三白花茶批號為 161122；α-淀粉酶（河南圣斯德，20180127）、α-葡萄糖苷酶（G5003100UN）及四氧嘧啶（純度≥98%，2244-11-3）均為Sigma 公司產(chǎn)品；CUSABIO 小鼠α-葡萄糖苷酶ELISA 試劑盒（貨號：CSB-E09907m，批號：Y13010138）、CUSABIO 小鼠胰島素試劑盒（貨號：CSB-E05071m，批號：X03010136）、淀粉酶試劑盒（貨號：C016，批號20181010），南京建成；其余化學試劑均為分析純。

1.2 實驗動物

實驗用SPF 級雄性昆明小鼠由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，鼠齡5 ～6 周，動物許可證號為SCXK(鄂)2004—0007，體重為（25±5）g。

1.3 方法

1.3.1 動物灌胃劑量、模型建立與分組

根據(jù)三白花代用茶推薦劑量及使用方案，取6 g·d-1的人用劑量；依據(jù)文獻[6]中動物與人體表面積比換算法，將其換算成小鼠用原顆粒量為0.78 mg·g-1·d-1。將含干魚腥草的三白花茶（以下論述為干魚腥草組）、鮮魚腥草的代用茶（以下論述為鮮魚腥草組）顆粒，以10 倍量新制沸水超聲提取30 min，離心取清液。取同批次雄性小鼠，依據(jù)體重編號并隨機分成正常組、模型組，按照文獻[4]的方法使用四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型。模型組造模前16 h 禁食不禁水，按200 mg·kg-1（小鼠體重）腹腔注射四氧嘧啶（2.5%生理鹽水溶液），正常組腹腔注射同劑量生理鹽水。造模小鼠72 h 后尾部取血，測定空腹血葡萄糖水平；將血糖值在11.0 mmol·L-1以上的小鼠定為糖尿病模型鼠，并依據(jù)體重編號并隨機分成模型組、干魚腥草組、鮮魚腥草組。模型小鼠數(shù)目不足時采用上述造模方法從正常組備用鼠中隨機選擇、造模并測試達標后隨機進入模型組、干魚腥草組、鮮魚腥草組中。

1.3.2 動物給藥

根據(jù)1.3.1 分組及折算后的給藥量，根據(jù)小鼠體重計算實際灌胃給藥量。正常組及模型組按0.1 mL/10 g（小鼠體重）給予生理鹽水；干、鮮魚腥草組藥液按0.1 g·mL-1的提取物濃度進行配制，并依據(jù)小鼠體重按上述給藥方案確定實際小鼠灌胃劑量。各組小鼠依規(guī)范灌胃并飼養(yǎng)14 d。

1.3.3 小鼠血清樣本采集及指標測定

于動物實驗第14 天灌胃完畢后，小鼠禁食不禁水12 h。摘除小鼠眼球方式取血，采用血糖試條測定空腹血糖值。血液滴入離心管中，置于冷凍離心機中，4 ℃下3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，嚴格按試劑盒說明書進行操作，檢測血清中胰島素的濃度。

1.3.4 干、鮮魚腥草組對α-淀粉酶的體外抑制實驗

根據(jù)文獻[7-8]的方法，采用碘比色法測定干、鮮魚腥草制備的三白花茶顆粒體外對α-淀粉酶活力的抑制率。將兩組顆粒粉碎過80 目篩，使用pH 值為6.8 的緩沖液配制成混懸液并超聲混勻。根據(jù)文獻[8]及預實驗結(jié)果，準確稱取淀粉酶、小麥淀粉并用pH值為6.8 的緩沖液溶解至終濃度分別為0.03 mg·mL-1、25 mg·mL-1，并與不同濃度的干、鮮魚腥草組（終濃度為0.1 ～10.0 mg·mL-1）混合并制成不同濃度的干、魚腥草組樣品液。同時制備不加干、鮮魚腥草混懸液的對照液（僅含小麥淀粉及淀粉酶），以及不含α-淀粉酶及淀粉僅含不同濃度樣品的去α-淀粉酶空白溶液。將上述溶液加入比色管中，搖勻，37 ℃水浴反應15 min。反應完畢后離心取上清液，嚴格按照淀粉酶試劑盒操作，并于660 nm 測試OD值，并通過公式（1）計算對α-淀粉酶的抑制率。每個樣品濃度制成3 個樣本反應并測試，取3 次測試結(jié)果的平均值。

式中：A樣品為不同濃度干、鮮魚腥草組樣品溶液吸光度值；A對照為未加樣品的吸光度值；A空白為未加淀粉酶、淀粉的不同濃度樣品溶液吸光度值。

1.3.5 干、鮮魚腥草組對α-葡萄糖酶的體外抑制實驗

根據(jù)文獻[9]的方法，采用ELISA 法測定干、鮮魚腥草制備的三白花茶顆粒體外對α-葡萄糖酶的抑制率。與1.3.4 處理方法一致，將兩組顆粒粉碎過80 目篩，使用pH 值為6.8 的緩沖液配制成不同濃度的混懸液；對照品為未加魚腥草的蔗糖樣品。二者與一定量α-葡萄糖苷酶混合；另一部分不與葡萄糖苷酶混合。嚴格按照α-葡萄糖酶試劑盒方法進行操作，測試反應后葡萄糖苷酶活力，并通過公式（2）計算對α-葡萄糖酶的抑制率。

式中：A空白為未加魚腥草樣本溶液吸光度值；A樣品為含魚腥草樣品溶液吸光度值；A背景為未加葡萄糖苷酶樣品溶液吸光度值。

1.3.6 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，并進行獨立樣本t檢驗，通過SPSS 17.0 完成統(tǒng)計分析；以P＜0.05 為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 動物觀察

造模前，各組小鼠活動狀況無明顯差異。隨著造模時間推移，模型組小鼠體重有增加趨勢，且發(fā)現(xiàn)墊料中尿液等分泌物增多，籠內(nèi)氣味較重。動物實驗開始前及至取樣本前動物平均體重見表1。結(jié)果顯示，模型組在飼養(yǎng)前后體重有顯著差異，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其他組有體重升高趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義。

表1 各組動物平均體重表（±s，n=6）

表1 各組動物平均體重表（±s，n=6）

注：“*”表示飼養(yǎng)前后體重有顯著性差異，P ＜0.05。

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2.2 不同組小鼠飼養(yǎng)前、后血糖測試結(jié)果

依照1.3.3 方法，各組造模后空腹血糖測試結(jié)果及飼養(yǎng)14 d 后小鼠空腹血糖測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，模型組、干魚腥草組、鮮魚腥草組造模后空腹血糖值均高于11.0 mmol·L-1，各組間無顯著性差異；而與正常組有顯著性差異，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。飼養(yǎng)14 d 后，干、鮮魚腥草組平均血糖值與模型組相比有明顯下降，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但3 組與正常組比較，平均血糖值依然偏高，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組動物平均血糖值表（±s，n=6）

表2 各組動物平均血糖值表（±s，n=6）

注：“*”表示與同實驗段正常組有顯著性差異；“◆”表示與同實驗段模型組有顯著性差異，P ＜0.05。

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2.3 不同組小鼠飼養(yǎng)后血清胰島素濃度

依照1.3.3 方法，各組14 d 飼養(yǎng)后血清胰島素濃度測試結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，模型組小鼠血清胰島素濃度明顯低于正常組，且有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；干、鮮魚腥草組血清胰島素濃度明顯高于模型組，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 各組動物血清胰島素濃度表（±s，n=6）

表3 各組動物血清胰島素濃度表（±s，n=6）

注：“*”表示與模型組胰島素濃度有顯著性差異，P＜0.05。

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2.4 鮮、干魚腥草組對α-淀粉酶的體外作用

依據(jù)1.3.4 方法，不同濃度鮮、干魚腥草對α-淀粉酶體外作用結(jié)果見表4。從表4 結(jié)果可以看出，從1.0 mg·mL-1劑量開始，鮮、干魚腥草組對α-淀粉酶有一定抑制作用，但濃度高于5.0 mg·mL-1以后其抑制率增長緩慢，沒有隨劑量明顯升高的趨勢。考慮到代用茶口感的要求，魚腥草濃度不能過高；由體外實驗結(jié)果并結(jié)合文獻[8-9]可知，無論是鮮魚腥草還是干魚腥草，其制備的三白花茶均對α-淀粉酶無較強的抑制作用。

表4 不同濃度鮮、干魚腥草組對α-淀粉酶的體外抑制率表（-x±s，n=3）

2.5 鮮、干魚腥草組對α-葡萄糖酶的體外作用

依據(jù)1.3.5 方法，不同濃度鮮、干魚腥草對α-淀粉酶體外作用結(jié)果見表5。從表5 結(jié)果可知，鮮、干魚腥草組對α-葡萄糖酶均有較強的抑制作用，在1.2 mg·mL-1時抑制率都能達到或接近50%。且從結(jié)果分析可知，從1.5 mg·mL-1開始，鮮魚腥草組抑制率明顯高于同濃度干魚腥草組，且有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

表5 不同濃度鮮、干魚腥草組對α-葡萄糖酶的體外抑制率表（-x±s，n=3）

3 結(jié)論

資料顯示，魚腥草及綠茶提取物均對糖尿病及其并發(fā)癥有輔助治療及緩解作用[2-5]。本次實驗圍繞已形成產(chǎn)品的“干魚腥草提取物+綠茶”代用茶顆粒及含鮮魚腥草提取物中試技術(shù)改造產(chǎn)品展開研究，在人常用量的基礎上，進行小鼠整體動物實驗及體外對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用實驗，確認其可能的輔助治療糖尿病的效應及機制。實驗結(jié)果顯示，常用劑量在小鼠灌胃實驗中，能明顯控制糖尿病模型鼠的體重增加趨勢，降低其異常升高的空腹血糖值，且使模型鼠血液中胰島素含量升高，從而達到控制糖尿病特征指標的效應。相關(guān)制劑體外實驗結(jié)果顯示，常用劑量下含鮮、干魚腥草的相關(guān)制劑對α-淀粉酶的抑制效果不明顯；對α-葡萄糖苷酶抑制效果明顯，且含鮮魚腥草提取物的制劑在1.5 mg·mL-1以上濃度時，抑制效果明顯強于含干魚腥草提取物的制劑。這為“三白花”代用茶今后的技術(shù)改造及產(chǎn)品升級奠定了一定基礎。

糖尿病已屬于與營養(yǎng)代謝有關(guān)的慢性非傳染性疾病，隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展及人們生活方式的轉(zhuǎn)變，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在糖尿病治療與癥狀控制的過程中，一定劑量的藥食同源類產(chǎn)品（如代用茶）可作為糖尿病人較為安全的臨床治療輔助手段。天然茶飲、藥食同源等輔助治療模式，是針對慢性非傳染性疾病的自然療法的重要方向。糖尿病作為慢性代謝性疾病，在特征性藥物控制的前提下，輔助以有劑量依據(jù)的能控制糖尿病指標的“三白花”茶等食療、茶療方案，為慢性非傳染性疾病的治療及癥狀控制提供了良好的研究思路及應用前景。