王燕,張夢圓,王蒙蒙,楊慧瑩,劉雨然,孫國結(jié),朱曉慶,谷新利

(石河子大學動物科技學院,新疆 石河子 832003)

抗菌藥物的大量使用導致細菌耐藥性增加,畜產(chǎn)品藥物殘留,對畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康造成極大危害,迫切需要研制安全、有效并能減緩細菌耐藥性產(chǎn)生的抗菌制劑。目前,中藥抗菌制劑已成為研究熱點。

產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌(Shiga toxin-producingE.coli,STEC)是重要的食源性人畜共患病病原,可導致人類腹瀉,出血性大腸炎,溶血性尿毒綜合征等,也是畜牧業(yè)以及動物產(chǎn)品中常見的致病菌[1]。

甘草味甘,易助濕壅氣,具有益氣補中,祛痰止咳,解毒等功效。從甘草中提取得到的甘草多糖(GUP),具有抗氧化、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、抗炎等作用[2-5]。硒作為人體必須微量元素之一,具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤等作用[6],在預防和治療人體各種疾病方面發(fā)揮著重要的作用。將GUP與硒經(jīng)化學反應合成的有機硒化物—硒化甘草多糖(SeGUP),兼具GUP和硒的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用,并能增強SeGUP的抑菌效果。王丹陽等[4]的研究發(fā)現(xiàn),SeGUP對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好體外抑菌效果。而關(guān)于SeGUP、GUP抑菌機制以及抗氧化作用得相關(guān)研究較少。因此,本文擬通過測定SeGUP、GUP對STEC半數(shù)抑制率(Half maximal inhibitory concentration,IC50)、生長曲線、細胞壁通透性、細胞膜完整性、生物被膜形成,以及對試驗動物的抗氧化作用來探究SeGUP、GUP抑菌活性、抑菌機制以及抗氧化效果,為進一步開發(fā)利用天然中草藥以及研發(fā)新型植物多糖抑菌劑提供理論基礎(chǔ),為SeGUP、GUP在緩解畜牧業(yè)氧化應激方面提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑

新疆烏拉爾甘草購自石河子市國浩中草藥公司;BHI、營養(yǎng)肉汁瓊脂均購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司;產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌(EscherichiacoliSTEC,菌株編號為BNCC186737)購自BeNa Culture Collection;堿性磷酸酶(AKP)試劑盒、BCA法蛋白含量測定試劑盒、β-半乳糖苷酶(β-gal)、小鼠過氧化氫酶(CAT)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;環(huán)磷酰胺(CY)購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Biotek SynergeyTM2多功能酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司;高速冷凍離心機購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;HVA-85高壓蒸汽滅菌鍋購自華粵行儀器有限公司;單道排槍移液器、多道排槍移液器均購自德國Transferpette公司。

1.1.3 試驗動物

潔凈級昆明小鼠,40只,雌雄對半,體重(20±2)g,購自新疆醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 硒化甘草多糖(SeGUP)、甘草多糖(GUP)制備

根據(jù)本實驗室連科迅[7]的制備方法,成功制備了SeGUP、GUP。

1.2.2 STEC菌液制備

將復蘇的STEC接種到營養(yǎng)肉汁瓊脂平板上,放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h,取大小均一的菌落接種至BHI液體培養(yǎng)基中,放置37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)6～8 h,所得菌液8 000 r·min-1離心5 min,棄去上清液用PBS洗滌兩次,離心同上,將菌液用PBS重懸并混勻,制成活菌數(shù)為108CFU·mL-1菌液,備用。

1.2.3 半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定

參考林震等[8]以及實驗室前期方法并稍作改進。使用PBS將SeGUP、GUP調(diào)整成濃度為50、100、150、200、250、300、350、400、450 mg·mL-1各5 mL的溶液,裝入高壓滅菌過的小錐形瓶,115 ℃高壓滅菌5 min,無菌密封4 ℃保存,短期使用。在超凈工作臺中將與STEC菌液同等體積的SeGUP、GUP溶液分別加入裝有STEC菌液試管中,使SeGUP、GUP終濃度分別為25、50、75、100、125、150、175、200、225 mg·mL-1,同時設(shè)置對照組只加入與STEC菌液同等體積的PBS(只含STEC菌液),在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)18 h后吸取200 μL加入到96孔板,測其在D600nm處吸光度值,通過Graphpad prism 7 計算SeGUP、GUPIC50。試驗重復3次。

1.2.4 SeGUP、GUP對STEC生長曲線的影響

參考Liu[9]以及實驗室前期方法適當修改,采用二倍稀釋法,SeGUP、GUP以及STEC菌液處理同1.2.3,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)24 h,每隔2 h吸取200 μL加入到96孔板,測其在D600nm處吸光度值,以時間為橫坐標,D值為縱坐標,繪制細菌生長曲線。每個時間段做3個平行組,取平均值。

1.2.5 SeGUP、GUP對培養(yǎng)液中AKP、β-gal、蛋白質(zhì)含量影響

在超凈工作臺中將與STEC菌液同等體積的SeGUP、GUP溶液分別加入裝有STEC菌液試管中,使SeGUP、GUP溶液濃度分別為150 mg·mL-1、200 mg·mL-1,同時設(shè)置對照組只加入與STEC菌液同等體積的PBS(只含STEC菌液),在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)12 h,定時于2、4、6、8、10、12 h無菌取樣1 mL于高壓滅菌過的EP管中,7 000 r·min-1離心10 min,取上清液待測,根據(jù)AKP、β-gal、蛋白質(zhì)試劑盒說明書操作,測量其在D450nm、D562nm吸光度值,計算樣品中AKP、β-gal、蛋白質(zhì)含量。每個樣品做3個平行組,取平均值。

1.2.6 SeGUP、GUP對STEC生物膜的影響

參考溫燕龍[10]和Djordjevic[11]方法稍作改進。在超凈工作臺中將與STEC菌液同等體積的SeGUP、GUP溶液分別加入裝有STEC菌液試管中,使SeGUP、GUP溶液濃度分別為150、200 mg·mL-1,同時設(shè)置對照組只加入與STEC菌液同等體積的PBS(只含STEC菌液),震蕩混勻,吸取200 μL的SeGUP、GUP與STEC菌液混合液到96孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h,棄去每孔中的混合液,使用PBS漂洗3次,再取200 μL結(jié)晶紫染液加到每孔中,37 ℃染色1 h,棄去每孔中的染色液,使用PBS漂洗3次,再吸取200 μL的95%乙醇加入每孔中,37 ℃脫色8 h后在D595nm處測其吸光度值。每個樣品做3個平行組,取平均值。

1.2.7 抗氧化試驗

將40只清潔級昆明小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后隨機分為對照組、模型組、SeGUP組(100 mg·kg-1)、GUP組(100 mg·kg-1),每組10只。第一天～第四天,模型組、SeGUP組、GUP組小鼠腹腔注射80 mg·kg-1CY,復制氧化應激模型。第5天起,對照組、模型組小鼠灌胃0.3 mL生理鹽水,SeGUP組、GUP組灌胃100 mg·kg-1SeGUP、GUP溶液,連續(xù)14 d,于末次給藥2 h后采用眼球摘除法采集小鼠血液,血液室溫下放置2 h,3 500 r·min-1離心10 min收集血清,按照SOD、CAT、MDA試劑盒說明書檢測SOD、CAT、MDA含量變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA),方差顯著或有影響趨勢者采用Duncan’s法進行多重比較,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。通過Graphpad prism 7繪制生長曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 SeGUP、GUP的IC50

SeGUP IC50、95%CI分別為55.58 mg.mL-1、47.71～63.73 mg.mL-1,均小于GUPIC50、95%CI,說明SeGUP的抑菌效果優(yōu)于GUP。結(jié)果見表1。

表1 SeGUP、GUP的IC50以及95%CI

2.2 SeGUP、GUP對STEC生長曲線的影響

由圖1、圖2可知,對照組中的STEC在8 h之前完成遲緩期與對數(shù)期,在8～24 h完成穩(wěn)定期與衰亡期;25～125 mg·mL-1SeGUP則可以使STEC提前進入穩(wěn)定期和衰亡期,且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢;25～175 mg·mL-1GUP可以使STEC提前進入穩(wěn)定期與衰亡期,但抑制細菌生長效果不穩(wěn)定,曲線會出現(xiàn)反增現(xiàn)象,GUP抑制STEC增殖效果不如SeGUP。

圖1 各濃度SeGUP對STEC的生長曲線的影響

圖2 各濃度GUP對STEC的生長曲線的影響

另外,與對照組相比較,各濃度的SeGUP、GUP均有抑制STEC生長趨勢,且隨著濃度的增加抑制效果越強,呈現(xiàn)劑量依賴趨勢。SeGUP在150、175、200、225 mg·mL-1時對STEC抑制效果最強,STEC呈現(xiàn)不增殖狀態(tài);GUP在200、225 mg·mL-1時對STEC抑制效果最強,STEC呈現(xiàn)不增殖狀態(tài),在進行抑菌機制研究時,SeGUP、GUP選取150、200 mg·mL-1濃度來進行抑菌機制試驗。

2.3 SeGUP、GUP對STEC培養(yǎng)液中AKP、β-gal、蛋白質(zhì)含量的影響

AKP是細胞壁完整性指標之一。由表2可知,0～12 h,隨著培養(yǎng)時間的增加,SeGUP組、GUP組、對照組3組中STEC細胞外液中AKP含量也逐漸增加,提示SeGUP、GUP對STEC細胞壁破壞程度呈現(xiàn)時間依賴趨勢。

表2 各組STEC培養(yǎng)液中不同時間AKP、β-gal、蛋白質(zhì)含量

其中,SeGUP組在STEC生長的2～6 h AKP含量變化不大,而6～8 h AKP含量突然增大,說明在6～8 h SeGUP使STEC菌體細胞壁完全破裂,AKP開始大量泄露;2～8 h GUP組AKP含量變化不大,8～10 h AKP含量突然增大,說明在8～10 h GUP能有效使STEC菌體細胞壁破裂,AKP開始大量泄露。在同一時間內(nèi),SeGUP組AKP含量極顯著高于GUP組(P<0.01),GUP組AKP含量極顯著高于與對照組(P<0.01),說明SeGUP、GUP能有效破壞細胞壁,SeGUP效果優(yōu)于GUP。

β-gal、蛋白質(zhì)是細胞膜通透性指標。SeGUP、GUP處理過的STEC培養(yǎng)液中β-gal、蛋白質(zhì)外漏嚴重,說明SeGUP、GUP能有效破壞STEC細胞膜,也呈現(xiàn)時間依賴趨勢。同一時間內(nèi)SeGUP組β-gal、蛋白質(zhì)含量極顯著高于GUP組、對照組含量(P<0.01),GUP組β-gal、蛋白質(zhì)含量極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.4 SeGUP、GUP對STEC生物被膜形成的影響

由表3可知,與對照組相比,SeGUP、GUP均能有效抑制生物被膜形成(P<0.01),SeGUP組抑制生物被膜的效果與GUP組抑制效果相比差異極顯著(P<0.01),且SeGUP組抑制生物被膜的效果優(yōu)于GUP組。

表3 各組對STEC生物被膜形成的影響

2.5 SeGUP、GUP對SOD、CAT、MDA含量的影響

由表4可知,模型組SOD、CAT含量極顯著低于其他組(P<0.01);SeGUP組SOD、CAT含量極顯著高于GUP組、對照組(P<0.01),GUP組SOD、CAT含量極顯著高于對照組(P<0.01)。SeGUP組中SOD、CAT含量最高。模型組MDA含量極顯著高于其他組(P<0.01),SeGUP組MDA含量極顯著低于GUP組、對照組,P<0.01。GUP組MDA含量極顯著低于對照組,P<0.01。SeGUP組MDA含量最低。

表4 各組血清中SOD、CAT、MDA含量

3 討論

半數(shù)抑制濃度(IC50)值常用來評估抑制劑的抑制效率[12]。本試驗通過SeGUP、GUP分別對STEC進行體外抑菌試驗,發(fā)現(xiàn)SeGUP不論是IC50還是抑制STEC增殖上效果均優(yōu)于GUP,這與田艷花、張百剛等[3,13]研究GUP能有效抑制大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的生長,王丹陽[4]使用SeGUP能有效抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌增殖結(jié)果一致。

菌體最外側(cè)層有一層堅韌的結(jié)構(gòu)—細胞壁,最基本功能就是維持菌體形態(tài),還參與了物質(zhì)運輸,起到保護菌體內(nèi)容物、減少菌體水分蒸發(fā)等作用。AKP是存在細胞壁與細胞膜之間的物質(zhì),可作為細胞壁完整性的指標之一[14]。本次試驗中,150 mg·mL-1SeGUP、200 mg·mL-1GUP有效提高培養(yǎng)液中AKP含量,提示SeGUP、GUP均能破壞STEC細胞壁結(jié)構(gòu)導致菌體死亡。Zhang等[15]得出蟬蟲草多糖可以破壞大腸桿菌的細胞壁以及細胞膜,菌液中AKP、β-gal含量均增加。細胞膜是穩(wěn)定菌體內(nèi)環(huán)境的重要結(jié)構(gòu),能篩選物質(zhì)進出菌體,維持菌體有利的生存狀態(tài)。若細胞膜破裂,內(nèi)容物外漏,外部環(huán)境中其他物質(zhì)隨意進出,菌體遭到破壞,細菌無法繼續(xù)生存[16]。150 mg·mL-1SeGUP、200 mg·mL-1GUP作用于STEC,培養(yǎng)液中β-gal、蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)時間依賴趨勢,說明SeGUP、GUP能有效破壞STEC細胞膜,造成菌體內(nèi)物質(zhì)外漏,SeGUP不但破壞細菌細胞膜濃度低且破壞細胞膜程度也強于GUP。Zhou等[17]以O(shè)NPG為指標檢測β-gal活性,得出綠茶多糖能破壞大腸桿菌細胞膜。Meng等[18]使用核桃分心木多糖提高大腸桿菌細胞膜通透性,導致水溶性蛋白增加而影響其他物質(zhì)進出菌體,造成菌體代謝紊亂,從而達到抑菌效果。細菌生物膜是一類粘附在生物與非生物表面的胞外蛋白、多糖等聚合物,只有迅速清洗才能去除生物膜,細菌在生物膜“庇護”下游走自由,一旦形成生物膜細菌將更難消除[19-21],本試驗SeGUP、GUP均可抑制STEC菌體生物膜形成,SeGUP比GUP更能降低生物膜形成,更好達到抑菌效果。

CY作為一種臨床常用的烷化劑,主要是通過干擾健康免疫細胞增殖、遺傳物質(zhì)功能等途徑導致免疫抑制和骨髓抑制[22],又可引起機體氧化應激。CY對小鼠抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生負面影響,主要降低小鼠血清中抗氧化物酶活性[23]。SOD、CAT是機體重要抗氧化的酶,可將自由基分解為分子氧和過氧化氫,降低極端氧水平,形成抵抗氧化應激第一道防線[24]。MDA是機體內(nèi)氧化產(chǎn)物和細胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應生成的產(chǎn)物,MDA含量側(cè)面反映體內(nèi)過氧化物產(chǎn)物含量,也是代表細胞受過氧化物等損傷程度。因此,MDA含量越低機體抗氧化損傷能力越強[25]。Luo等[26]研究了番石榴葉多糖的抗氧化活性,表明番石榴葉多糖能有效清除自由基,顯著降低MDA、升高SOD活性。本文中SeGUP、GUP能提高SOD、CAT活力,降低MDA含量,提高抗氧化酶的活性,增強機體細胞抗氧化能力,且SeGUP效果優(yōu)于GUP。姚萬玲[27]研究表明硒化黨參多糖與黨參多糖比較能顯著提高小鼠體內(nèi)CAT含量、降低MDA含量,硒化黨參多糖抗氧化能力優(yōu)于黨參多糖。張陽等[28]研究硒化修飾白術(shù)多糖能顯著提高小鼠體內(nèi)SOD活力、降低MDA含量,效果優(yōu)于未修飾的白術(shù)多糖,均與本試驗結(jié)果一致,能為臨床開發(fā)抗氧化劑提供理論思路。

4 結(jié)論

(1)SeGUP、GUP對STEC均有較好的體外抑菌效果,SeGUP不但抑制STEC增殖濃度低于GUP,且體外抑菌效果也優(yōu)于GUP。

(2)SeGUP、GUP能有效破壞STEC膜結(jié)構(gòu),AKP、β-gal、蛋白質(zhì)含量、生物膜形成比較均有統(tǒng)計學差異,具有良好的抑菌效果,且SeGUP對STEC膜結(jié)構(gòu)的破壞力強于GUP。

(3)SeGUP、GUP均提高了抗氧化能力,且硒化修飾的GUP抗氧化能力優(yōu)于GUP。