楊小鳳,林若琳,王小鵬,朱麗,侯雋,王良海

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。我國(guó)肝癌的發(fā)病率居世界首位,對(duì)全球肝病的負(fù)擔(dān)有著重大影響[2]。越來(lái)越多的證據(jù)表明肝癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞失調(diào),包括巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加和T細(xì)胞浸潤(rùn)減少等[3-4]。肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后標(biāo)志物仍有待于進(jìn)一步研究[5]。

研究表明,腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞與許多類型癌癥患者的良好預(yù)后相關(guān)[6]。趨化因子是8-14 KDa的小分子蛋白,存在于淋巴系統(tǒng)和各種組織中,在招募免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。CCL5(C-C motif chemokine ligand 5),也被稱為RANTES,是大小為7.5 kDa的趨化因子[3]。CCL5已被發(fā)現(xiàn)在癌癥和炎癥性疾病中起重要作用[8-9]。Dangaj等[10]通過(guò)對(duì)人卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞表達(dá)的CCL5和由巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞表達(dá)的CXCL9對(duì)T細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤組織中至關(guān)重要 。Tang等發(fā)現(xiàn)CCL5可作為非小細(xì)胞肺癌的疾病預(yù)后指標(biāo)和免疫檢查點(diǎn)治療靶點(diǎn)[11]。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)CCL5缺乏可增強(qiáng)結(jié)直腸癌中CD8+T細(xì)胞的瘤內(nèi)浸潤(rùn)。然而,目前CCL5在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平和作用機(jī)制還沒(méi)有明確的定論[3,7,13]。

本研究通過(guò)分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)肝癌組織中CCL5表達(dá)較低并與患者預(yù)后不良相關(guān)。我們還對(duì)人肝癌組織標(biāo)本中CCL5的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),驗(yàn)證了上述生物信息學(xué)結(jié)果。我們分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)CCL5與肝癌的免疫微環(huán)境有關(guān),高表達(dá)組浸潤(rùn)更多的CD8+T細(xì)胞。此外,過(guò)表達(dá)CCL5能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤中CCL5的低表達(dá)是由啟動(dòng)子DNA高甲基化引起的。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

1.1.1 Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)

GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是存儲(chǔ)并免費(fèi)分發(fā)微陣列、下一代測(cè)序(NGS)和其他形式高通量功能基因組數(shù)據(jù)的國(guó)際公共存儲(chǔ)庫(kù)[14]。本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析了CCL5在肝癌組織中的表達(dá)高低及與患者的生存預(yù)后情況的關(guān)系。

1.1.2 The Cancer Genome Atlas Program(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)

TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)的研究人員對(duì)來(lái)自33種癌癥類型的11 160名患者的腫瘤分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了描述,并確定了它們的分子亞型[15]。本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)集分析了CCL5與免疫浸潤(rùn)及甲基化的關(guān)系。

1.2 臨床樣本

收集石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2011—2019年期間的肝癌石蠟組織標(biāo)本,其中腫瘤組織103個(gè),癌旁組織90個(gè)。這些患者在手術(shù)切除前均未接受放療或化療。所有患者均由至少兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行病理診斷。本研究經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院人體研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

將石蠟包埋組織切成4 μm厚的切片,經(jīng)二甲苯脫蠟、酒精脫水后進(jìn)行抗原修復(fù)。然后用3% H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌3次,每次5 min。洗滌后,將樣品與抗CCL5一抗混合(稀釋比1∶500;Abcam),在4 ℃的冰箱中孵育過(guò)夜。加二抗后將石蠟切片置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min。采用DAB試劑盒(ZSGB-Bio #ZLI-9018)對(duì)樣品進(jìn)行顯色。將組織切片沖洗后用蘇木素快速染色,中性樹膠封片。根據(jù)著色強(qiáng)度(0分:未著色;1分:弱著色;2分:中等著色;3分:強(qiáng)著色)和著色細(xì)胞比例(0分:<5%;1分:5%～25%;2分:26%～75%;3分:75%～100%)對(duì)CCL5表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色程度進(jìn)行評(píng)分,每個(gè)樣本的最終免疫反應(yīng)性評(píng)分為著色強(qiáng)度評(píng)分和著色細(xì)胞比例評(píng)分的乘積[16-17]。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與主要試劑

人肝癌細(xì)胞株HuH-7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),MHCC97 H購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司,小鼠肝癌細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)贈(zèng)送。HuH-7、MHCC97 H和小鼠肝癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。主要試劑見表1。

表1 主要試劑及公司

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

小鼠肝癌細(xì)胞接種于六孔板中,細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)CCL5及其相應(yīng)對(duì)照的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后,用嘌呤霉素處理細(xì)胞14 d,進(jìn)行單克隆篩選,構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的CCL5細(xì)胞系。

1.6 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)

CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的小鼠肝癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖。將約2 500個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中,細(xì)胞貼壁后,在不同時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h。測(cè)定450 nm處吸光度,繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.7 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用 E.N.Z.A. Total RNA Kit I從細(xì)胞中分離出總RNA,NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA濃度。將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)采用β-actin作為內(nèi)參,應(yīng)用2-△△CT法分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的表達(dá)差異倍數(shù)。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn),多組間比較采用單因素或雙因素方差分析估計(jì)。生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異顯著。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.000 1。

2 結(jié)果

2.1 CCL5在肝癌組織中顯著低表達(dá)

肝癌數(shù)據(jù)集GSE14520用來(lái)分析CCL5在肝癌中的表達(dá)分布?；鹕綀D顯示CCL5為肝癌組織中差異表達(dá)基因的下調(diào)基因之一(P<0.05,圖1A)。在配對(duì)(P<0.001,圖1B)和非配對(duì)(P<0.001,圖1C)的肝癌樣本中,CCL5的表達(dá)都顯著降低。

A:對(duì)GSE14520數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異基因分析,火山圖顯示CCL5是肝癌中的一個(gè)下調(diào)基因;藍(lán)色:下調(diào)基因;紅色:上調(diào)基因;B-C:CCL5在配對(duì)的(B)和非配對(duì)的(C)肝癌樣本中均低表達(dá)。圖1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析CCL5在肝癌組織中的表達(dá)水平

為了進(jìn)一步明確CCL5在肝癌中的表達(dá)情況,我們采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)人肝癌組織及癌旁組織中CCL5的蛋白表達(dá)。CCL5信號(hào)主要定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖2A)。免疫組織化學(xué)染色評(píng)分的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明肝癌組織中CCL5的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05,圖2B)。綜上所述,CCL5在肝癌組織中表達(dá)降低。

圖2 CCL5在臨床樣本中的表達(dá)水平分析

2.2 CCL5低表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后有關(guān)

我們?cè)贕SE14520數(shù)據(jù)集中分析了CCL5表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示,當(dāng)CCL5表達(dá)較低時(shí),患者的總生存率(P<0.05,圖3A)和無(wú)復(fù)發(fā)生存率(P<0.05,圖3B)較差;CCL5表達(dá)高時(shí),有利于患者的預(yù)后。

A-B:CCL5表達(dá)情況對(duì)肝癌患者的總生存期(A)或無(wú)復(fù)發(fā)生存期(B)的影響。圖3 GSE14520數(shù)據(jù)集中分析CCL5表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)

2.3 CCL5低表達(dá)與免疫抑制有關(guān)

Thorsson Vesteinn等人[18]的研究將免疫表型分為C1-C6型,依次由免疫浸潤(rùn)型向免疫荒漠型轉(zhuǎn)變,不同亞型提示患者的免疫應(yīng)答類型及不同預(yù)后結(jié)局。

我們分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝癌免疫表型發(fā)現(xiàn)CCL5低表達(dá)組富集到更多的C4(淋巴細(xì)胞減少)亞型,該亞型與免疫抑制及預(yù)后差相關(guān);而C2型(干擾素-γ為主)和C3型(炎性因子)在CCL5高表達(dá)組中富集(P<0.001),圖4A和4B,提示CCL5高表達(dá)有利于患者預(yù)后且表現(xiàn)為免疫浸潤(rùn)性微環(huán)境。

A:CCL5在6種免疫亞型(C1-C6)肝癌組織中的表達(dá)水平分布;B:CCL5在C2-C4免疫亞型中的表達(dá)水平比較。圖4 CCL5低表達(dá)與免疫抑制表型相關(guān)

對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中高表達(dá)CCL5組和低表達(dá)CCL5組的免疫評(píng)分進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)(圖5A),低表達(dá)CCL5組的免疫評(píng)分較低(P<0.001),這意味著低表達(dá)CCL5組的免疫微環(huán)境較差。我們進(jìn)一步在肝癌數(shù)據(jù)集GSE14520中分析CCL5表達(dá)水平與免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況,發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞在CCL5高表達(dá)組浸潤(rùn)較多(圖5B)。綜上所述,CCL5低表達(dá)與肝癌的免疫抑制微環(huán)境有關(guān)。

圖5 CCL5低表達(dá)的肝癌組織顯示較低的免疫評(píng)分

2.4 CCL5過(guò)表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖

細(xì)胞過(guò)度增殖是癌變的重要特征之一[19]。我們通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證了CCL5過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的成功構(gòu)建(P<0.01,圖6A)。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CCL5過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖速度低于CCL5對(duì)照組(P<0.001,圖6B),表明CCL5過(guò)表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

圖6 CCL5過(guò)表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖

2.5 CCL5表達(dá)低與DNA高甲基化有關(guān)

我們通過(guò)MEXPRESS網(wǎng)站分析了CCL5在TCGA數(shù)據(jù)集肝癌組織中低表達(dá)的可能原因。結(jié)果表明,CCL5表達(dá)與拷貝數(shù)無(wú)顯著關(guān)聯(lián),與啟動(dòng)子DNA的甲基化呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05,圖7A)。CCL5低表達(dá)組具有顯著升高的啟動(dòng)子DNA甲基化水平(圖7B)。

A:Mexpress(https://www.mexpress.be/index.html/)顯示肝癌組織中CCL5表達(dá)與甲基化負(fù)相關(guān)。B:小提琴圖顯示了肝癌中CCL5表達(dá)與甲基化水平的關(guān)系。C:5’-Aza-2’-deoxycytidine和 DZNeP(均為1 μmol·L-1)處理肝癌細(xì)胞48小時(shí)后的CCL5的表達(dá)水平。圖7 CCL5表達(dá)水平與甲基化呈負(fù)相關(guān)

為了驗(yàn)證CCL5與甲基化的關(guān)系,我們?cè)隗w外對(duì)HuH-7和MHCC97H兩株肝癌細(xì)胞系進(jìn)行了甲基化抑制劑處理。5’-aza-2’-deoxycytidine是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,DZNeP是組蛋白甲基化抑制劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑組的CCL5表達(dá)較未處理組顯著增加,提示CCL5在肝癌細(xì)胞中的低表達(dá)是由高甲基化引起的。

3 討論

肝細(xì)胞癌發(fā)生在慢性肝臟炎癥的環(huán)境中,與肝炎病毒慢性感染和酒精或黃曲霉毒素暴露等密切相關(guān)。深入地了解肝癌的病因和發(fā)病機(jī)制,有助于為肝癌患者的治療提供更多可能性[20]。

趨化因子的異常表達(dá)可以影響腫瘤組織中免疫細(xì)胞的遷移,形成腫瘤微環(huán)境,導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[3,21]。CCL5是CC型趨化因子家族成員之一,與腫瘤和炎癥性疾病密切相關(guān)[22]。

本文就CCL5對(duì)肝癌免疫微環(huán)境及腫瘤細(xì)胞的影響為切入點(diǎn),初步探討了CCL5在肝癌進(jìn)展中的作用。我們首先通過(guò)生物信息學(xué)手段,在肝癌數(shù)據(jù)集GSE14520中發(fā)現(xiàn)CCL5的表達(dá)降低。為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)集結(jié)果的準(zhǔn)確性,我們收集了103例肝細(xì)胞癌組織和90例鄰近組織作為對(duì)照,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色證實(shí)了CCL5在腫瘤中低表達(dá)。預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)CCL5低表達(dá)的患者總體生存期較差,更容易復(fù)發(fā),提示CCL5低表達(dá)可能促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。然而,CCL5在乳腺癌等腫瘤組織中的表達(dá)升高,沉默CCL5表達(dá)能夠抑制乳腺癌干細(xì)胞的增殖和侵襲能力[23-24],表明CCL5可能在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中存在特異性的作用,值得廣大研究者進(jìn)一步研究。

CCL5/CCR5信號(hào)通過(guò)NF-κB通路加速肝臟炎癥反應(yīng)[25]。在風(fēng)濕病患者滑膜積液和組織中檢測(cè)到CCL5表達(dá)水平的升高,伴隨著滑膜積液中CCR5+T細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞明顯增加和積累[9]。文獻(xiàn)還提示CCL5/CCR5與慢性炎癥性腸病有關(guān)[26]。本文分析CCL5表達(dá)與腫瘤組織中的6種免疫分子亞型(C1:傷口愈合;C2:干擾素-γ為主;C3:炎性因子;C4:淋巴細(xì)胞減少;C5:免疫靜止;C6: TGF-β為主)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),CCL5低表達(dá)與C4淋巴細(xì)胞減少型密切相關(guān),而CCL5高表達(dá)組表達(dá)更多的C2、C3炎性細(xì)胞浸潤(rùn)亞型,說(shuō)明CCL5在肝癌中與免疫抑制性微環(huán)境有關(guān)。不僅如此,我們還發(fā)現(xiàn)CCL5低表達(dá)組的免疫評(píng)分也較低,高表達(dá)組則CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)較多。

本文進(jìn)一步探索了肝癌中CCL5降低的原因。Mexpress網(wǎng)頁(yè)分析顯示,CCL5表達(dá)與甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。肝癌細(xì)胞系用甲基化抑制劑處理后能夠使CCL5的表達(dá)升高,提示CCL5在肝癌中表達(dá)降低與高甲基化狀態(tài)有關(guān)。此外,腫瘤的發(fā)生發(fā)展總伴隨著腫瘤細(xì)胞的異常增殖。我們體外構(gòu)建了CCL5過(guò)表達(dá)小鼠細(xì)胞系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CCL5使細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組下降,說(shuō)明CCL5過(guò)表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖。

總的來(lái)說(shuō),本研究發(fā)現(xiàn)CCL5在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下降并與患者預(yù)后不良相關(guān)。CCL5低表達(dá)誘導(dǎo)了肝癌免疫抑制性微環(huán)境及腫瘤細(xì)胞增殖。CCL5低表達(dá)是由細(xì)胞內(nèi)的一種內(nèi)源性因素(高甲基化)引起的。CCL5可作為肝癌的一種抑癌因子和預(yù)后指標(biāo)。