李夢環(huán),馬丁凌,唐意涵,袁成鋼,王翠喆,張君

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室,新疆 石河子 832000)

糖尿病患病率在世界范圍內(nèi)呈持續(xù)增長狀態(tài),并已成為世界第5位死亡主因[1]。根據(jù)《IDF全球糖尿病地圖(第 10 版)》數(shù)據(jù)顯示,預(yù)計到2045年,全球糖尿病患病人數(shù)將達(dá)7.83億人,其中2型糖尿病(Type2 Diabetes Mellitus, T2DM)約占90%[2]。肥胖是胰島素抵抗(Insulin Resistance, IR)和T2DM發(fā)生發(fā)展的重要誘因,80%的T2DM患者伴有肥胖[3-4]。盡管多項研究顯示肥胖是產(chǎn)生IR的根源,也是T2DM發(fā)生的重要原因,但肥胖誘發(fā)T2DM的具體分子機制尚不十分明確。

最近的研究顯示,脂肪組織是循環(huán)外泌體微小核糖核酸(microRNAs, miRNAs)的一個重要來源,作為新式脂肪因子miRNAs可調(diào)節(jié)鄰近或遠(yuǎn)處組織中受體細(xì)胞的功能[5]。已有研究表明:肥胖個體血清和組織中miRNAs的含量發(fā)生變化,可通過影響相關(guān)基因的表達(dá)誘發(fā)IR,在T2DM、心血管疾病和代謝綜合征等發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[6-9]。作為新型脂肪因子,miRNAs對于預(yù)防和治療肥胖相關(guān)代謝性疾病具有廣闊的應(yīng)用前景。課題組前期研究發(fā)現(xiàn):肥胖受試個體及飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠血清中miR-4431含量顯著增加,并且在體外細(xì)胞實驗中證實:miR-4431可通過抑制糖代謝關(guān)鍵基因TRIP10 和PRKD1的表達(dá),誘發(fā)肝細(xì)胞IR和糖耐量受損[10]。然而,有關(guān)肥胖導(dǎo)致miR-4431含量增加的原因,尚未見文獻(xiàn)報道。

肥胖后,脂肪組織過度蓄積,導(dǎo)致脂解作用增強,進而引起血漿中游離脂肪酸(Free fatty acids,FFAs)含量增加。過量的血清FFAs水平會減少外周葡萄糖攝取,增加肝臟葡萄糖生成,可誘發(fā)脂肪組織炎癥和IR[11]。課題組已有研究結(jié)果表明:無論在正常體重還是肥胖個體血漿中,長鏈脂肪酸棕櫚酸(Palmitic acid,PA)的含量在34種FFAs中豐度最高,并且肥胖個體血漿中PA含量高于正常體重個體,提示PA可能在肥胖導(dǎo)致相關(guān)代謝性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是絕大部分細(xì)胞中的重要細(xì)胞器,在維持細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)與生物大分子合成中起著關(guān)鍵作用。已有文獻(xiàn)表明,肥胖后脂肪酸和葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)過量可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)的發(fā)生,而這種反應(yīng)與IR和T2DM的發(fā)展過程密切相關(guān)[13-17]。肥胖后PA含量增加是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑導(dǎo)致miR-4431的含量增加,尚未見文獻(xiàn)報道。

本研究在收集正常體重及肥胖受試個體腹部脂肪組織,以及構(gòu)建飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型的基礎(chǔ)上,比較受試個體血清中miR-4431的含量差異以及腹部脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物PERK、IRE1α、ATF6及miR-4431的表達(dá)差異;在體外培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞的基礎(chǔ)上,明確PA處理對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物及miR-4431表達(dá)及釋放水平的影響,嘗試闡明肥胖后miR-4431表達(dá)及釋放增加的可能原因,為進一步探討肥胖后脂肪組織源性microRNAs表達(dá)及釋放增加的分子機制提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究所涉及的受試個體及實驗動物均獲得石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號: 2017-049-01;編號: A2017-115-01)。2021年5月～12月,在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收集12例受試個體腹部脂肪組織樣本,包括6例正常體重及6例肥胖受試個體,所有受試個體均簽署知情同意書;于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司購買C57BL/6雄性小鼠12只,分為普通飲食喂養(yǎng)組(n=6)和高脂飲食喂養(yǎng)組(n=6)。

1.2 細(xì)胞系及體外培養(yǎng)試劑

本研究所用3T3-L1細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。當(dāng)25T培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長至80%～100%時即可進行傳代處理。將細(xì)胞接種在六孔板中2～3 d后,細(xì)胞密度達(dá)到100%時,使用細(xì)胞分化誘導(dǎo)液Ⅰ(DMEM高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清、10 μg·mL-1胰島素、1 μmol·L-1·L-1地塞米松及 0.5 mmol·L-13-異丁基-1-甲基黃嘌呤)刺激細(xì)胞48 h后;使用誘導(dǎo)液Ⅱ(含DMEM高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清、10 μg·mL-1胰島素及1 μmol·L-1·L-1地塞米松)刺激細(xì)胞48 h;半換含 DMEM高糖培養(yǎng)基和10%胎牛血清的混合培養(yǎng)基;24 h后,全部更換培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基和10%胎牛血清的混合培養(yǎng)基。待細(xì)胞成功誘導(dǎo)出大脂滴后,分別使用200 μmol·L-1和500 μmol·L-1PA進行處理。

1.3 棕櫚酸溶液(palmitic acid, PA)配制

使用分析天平稱取棕櫚酸粉末0.025 64 g,溶于1 mL無水乙醇中。將充分溶解的棕櫚酸加至20%無脂肪酸BSA溶液,充分混勻后,使用0.22 μm的濾器進行過濾,分裝備用,-80 ℃保存。

1.4 組織與細(xì)胞RNA提取

提前預(yù)冷無酶 EP 管、三氯甲烷、異丙醇、75%酒精及低溫超速離心機至 4 ℃。PA處理細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液后,使用1 ml 1×PBS 清洗細(xì)胞,Trizol法提取組織及細(xì)胞總RNA。

1.5 miRNAs反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR

實驗所用miRNAs反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR試劑盒購買于北京天根公司,根據(jù)說明書進行操作,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 肥胖小鼠模型構(gòu)建

使用高脂飼料(含5%PA的60%fat Kcal%,購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司)喂養(yǎng)雄性C57BL/6小鼠11周,構(gòu)建肥胖小鼠模型;普通飼料(含10%fat Kcal%,購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司)喂養(yǎng)雄性C57BL/6小鼠11周,作為普通飲食對照組。

通過比較小鼠體重及血糖水平判定肥胖模型是否構(gòu)建成功。高脂飲食喂養(yǎng)組小鼠體重大于普通飲食組20%,血糖顯著高于普通飲食組,認(rèn)為肥胖小鼠模型構(gòu)建成功。

飼養(yǎng)小鼠11周后,評價小鼠胰島素敏感性及葡萄糖耐受能力;內(nèi)眥取血,4 000 r·min-1,離心5 min,收集血清;脫頸處死小鼠后,收集小鼠肝臟及各脂肪組織,稱取重量,所有組織-80 ℃保存。

1.7 小鼠葡萄糖耐量(Intraperitoneal Glucose Tolerance Trial, IPGTT)和胰島素敏感性(Insulin Tolerance Test, ITT)實驗

IPGTT實驗前,對小鼠進行饑餓12 h,斷尾檢測血糖,記為0 min。對小鼠進行腹腔注射無水葡萄糖,無水葡萄糖用量:2 g·kg-1(5 g 無水葡萄糖溶于10 mL 生理水,每只小鼠葡萄糖用量=體重(g) ×4 μL);檢測小鼠15、30、45、60、90、120 min血糖水平。

ITT實驗前,對小鼠進行饑餓6 h,斷尾檢測血糖,記為 0 min。ITT 諾和靈30R用量:0.5 IU·kg-1(4 μL的 insulin 溶于 2 mL 生理鹽水,每只小鼠胰島素用量=體重(g) ×2.5 μL);測量小鼠15、30、45、60、90、120 min。

實驗過程中,倘若小鼠出現(xiàn)抽搐無力,立即大量注射葡萄糖(100 μL·只-1),密切關(guān)注小鼠狀態(tài) 3～5 min,可進行多次注射。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 26.0 軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。服從正態(tài)分布或方差齊的兩組計量數(shù)據(jù)采用t檢驗,非正態(tài)分布的兩組計量數(shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗,P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肥胖個體脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物及miR-4431表達(dá)水平增加

比較受試個體一般資料和生化指標(biāo)后發(fā)現(xiàn):肥胖個體(n=6,男性3例,女性3例)體重和體質(zhì)指數(shù)顯著高于正常體重(n=6,男性2例,女性4例)個體(P<0.05),結(jié)果見表2。

表2 受試個體一般資料

比較受試個體腹部脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物及miR-4431表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn):與正常體重受試個體相比,肥胖受試個體脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物PERK、IRE1α、ATF6及miR-4431的表達(dá)水平均顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖1A～圖1D)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示:脂肪組織中miR-4431表達(dá)水平與受試個體血糖水平、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物PERK、IRE1α、ATF6正相關(guān)(圖1E～圖1H)。

A: PERK;B: IRE1α;C: ATF6;D: miR-4431;E-H:miR-4431與血糖、PERK、IRE1α、ATF6斯皮爾曼相關(guān)分析。*P <0.05,**P <0.01, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物PERK、IRE1α、ATF6及miR-4431在正常(n=6)和肥胖個體(n=6)脂肪組織中的表達(dá)水平

2.2 肥胖小鼠脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物及miR-4431表達(dá)增加,血清中miR-4431含量增加

高脂飲食喂養(yǎng)雄性C57BL/6小鼠11周后,小鼠體重顯著高于普通飲食喂養(yǎng)組(大于20%,P<0.05)(圖2A,圖2B)。且小鼠血糖水平較普通飲食組相比顯著升高,葡萄糖耐量及胰島素敏感性明顯受損(P<0.05)(圖2C～圖2E)。提示通過含5%的棕櫚酸高脂飼料喂養(yǎng)11周后,成功構(gòu)建肥胖小鼠模型。

A:小鼠大體圖片;B:小鼠體重;C:血糖;D:小鼠葡萄糖耐量;E:胰島素敏感性;F-I:附睪脂肪組織中PERK、IRE1α、ATF6、miR-4431的表達(dá)水平;J:血清中miR-4431的釋放水平;K-N:miR-4431表達(dá)水平與血糖、PERK、IRE1α、ATF6的相關(guān)性分析。*P <0.05,**P <0.01, ***P <0.001,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;斯皮爾曼相關(guān)分析,P <0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖2 正常飲食(NCD)以及高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)小鼠肥胖相關(guān)指標(biāo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物及miR-4431含量的比較

比較小鼠附睪脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物PERK、IRE1α、ATF6、miR-4431的表達(dá)水平及血清中miR-4431含量后發(fā)現(xiàn):內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物PERK、IRE1α、ATF6及miR-4431在肥胖小鼠附睪脂肪組織中顯著高表達(dá),同時小鼠血清中miR-4431含量顯著增加(P<0.05)(圖2F～圖2J)。脂肪組織miR-4431表達(dá)水平與小鼠血糖水平及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物PERK、IRE1α、ATF6的表達(dá)水平均顯著正相關(guān)(P<0.05)(圖2K～圖2N)。

2.3 PA促進脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及miR-4431的表達(dá)和釋放

體外培養(yǎng)3T3-L1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞,分別使用200 μmol·L-1和500 μmol·L-1PA處理24 h后,檢測細(xì)胞脂質(zhì)合成能力及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物PERK、IRE1α、ATF6的表達(dá)水平,以及miR-4431表達(dá)和釋放水平,結(jié)果顯示:與NC組相比,200 μmol·L-1及500 μmol·L-1PA處理均可顯著促進細(xì)胞脂質(zhì)合成(圖3A)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物PERK、IRE1α、ATF6以及miR-4431的表達(dá)水平,同時細(xì)胞培養(yǎng)上清中miR-4431的含量也顯著升高(P<0.05)(圖3B～圖3F)。

A:油紅O鑒定;B～D:檢測細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物PERK、IRE1α、ATF6的表達(dá)水平;E～F:miR-4431表達(dá)和釋放水平。*P <0.05,**P <0.01, ***P <0.001,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖3 PA處理3T3-L1脂肪細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和miR-4431表達(dá)及釋放的影響

2.4 miR-4431上游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測

運用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TransmiR預(yù)測miR-4431上游轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)果顯示:DDX5可能為miR-4431的上游轉(zhuǎn)錄因子(圖4A)。進一步使用hTFtarget數(shù)據(jù)庫預(yù)測DDX5的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)后發(fā)現(xiàn)。共有205個轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控DDX5,涉及的通路包括細(xì)胞增殖與凋亡、免疫調(diào)控、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等,其中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子包括:XBP1、ETS1、ATF2、ATF3、CEBPA、CEBPB等18個轉(zhuǎn)錄因子其具體功能見表3和圖4B。

A:miR-4431上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子;B:DDX5上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。圖4 生物信息學(xué)分析miR-4431及DDX5上游轉(zhuǎn)錄因子

表3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控的DDX5上游轉(zhuǎn)錄因子

3 討論

2型糖尿病(T2DM)是世界上患病率增長速度最快的代謝性疾病[18]。調(diào)查結(jié)果顯示[19-20],目前中國成年人T2DM患病率達(dá)11.6%,并且有50.1%處于前糖尿病狀態(tài),已成為全世界T2DM患者最多的國家。肥胖是胰島素抵抗(Insulin Resistance, IR)和T2DM發(fā)生的重要誘因之一,但肥胖誘發(fā)T2DM的具體分子機制尚不完全清楚。在過去的幾十年里,越來越多的證據(jù)表明,脂肪組織已不再是單純的能量儲備器,還是機體最大的內(nèi)分泌器官[21],可以分泌多種脂肪因子從而參與調(diào)節(jié)機體生長發(fā)育、代謝、免疫應(yīng)答等生物過程[22]。肥胖狀態(tài)下,脂肪因子表達(dá)譜的改變,對了解肥胖與糖脂代謝紊亂的關(guān)系具有一定意義。新式脂肪因子miRNAs自從被發(fā)現(xiàn)以來就備受關(guān)注,作為一類非編碼小RNA,廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控[23]。近年來,隨著miRNAs在糖脂代謝領(lǐng)域中的作用越來越受到重視,其作為肥胖相關(guān)代謝性疾病的診斷標(biāo)志物和治療靶點的應(yīng)用前景十分廣闊。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn),miR-4431在肥胖個體血清中的含量顯著增加,并與受試個體血糖水平顯著正相關(guān),體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)miR-4431可通過抑制下游糖代謝相關(guān)基因的表達(dá),誘發(fā)靶細(xì)胞的IR[10]。最近的研究報道,脂肪組織是循環(huán)miRNAs的一個重要來源,大量學(xué)者的工作證實:肥胖個體血清和組織中miRNAs的含量發(fā)生變化[9]。本研究在肥胖受試個體和飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織中,均發(fā)現(xiàn)miR-4431表達(dá)量增加,同時肥胖小鼠血清中miR-4431含量也出現(xiàn)相應(yīng)的增加。以上結(jié)果初步提示:miR-4431可能來源于脂肪組織,尚需進一步的研究加以證實。肥胖導(dǎo)致miR-4431高表達(dá)的分子機制目前尚不清楚。已有文獻(xiàn)報道,miRNAs的生物發(fā)生需要Dicer、Drosha等多種剪切酶的參與,Soufi FG等人的研究證明,高血糖患者臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中參與miRNAs成熟的基因Dicer、Drosha、DGCR8和Ago-2的表達(dá)水平顯著增加[24]。

此外,肥胖后體內(nèi)游離脂肪酸過度蓄積(以棕櫚酸PA的含量最為豐富),可誘發(fā)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[13-17],而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)也可導(dǎo)致miRNAs含量的增加,如Xu等[25]的研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠特異性誘導(dǎo)肝細(xì)胞中miR-26a的上調(diào),Hiramatsu N的研究同樣證實了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激廣泛重塑miRNAs轉(zhuǎn)錄組,誘導(dǎo)miR-215、miR-483和miR-616的表達(dá)[26]。本研究結(jié)果表明:肥胖受試個體的脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物顯著高表達(dá),相關(guān)性分析結(jié)果顯示:脂肪組織miR-4431表達(dá)水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物表達(dá)水平顯著正相關(guān)。此外,本研究體外實驗結(jié)果表明:高濃度PA可上調(diào)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá),同時促進了miR-4431的表達(dá)和釋放。進一步運用TransmiR數(shù)據(jù)庫預(yù)測后發(fā)現(xiàn):在miR-4431的上游轉(zhuǎn)錄因子中有18個與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。以上結(jié)果提示:肥胖后棕櫚酸PA含量的增加可能通過誘發(fā)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,促進miR-4431的表達(dá)和釋放,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后具體以何種途徑發(fā)揮上述作用,值得今后更深入的研究加以探索和證實。

綜上所述,本研究通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn),肥胖后脂肪組織miR-4431表達(dá)及釋放水平顯著增加,且miR-4431的高表達(dá)可能受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控。在本研究基礎(chǔ)上,深入開展內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響miR-4431表達(dá)及釋放的分子機制研究,將為肥胖及相關(guān)代謝性疾病的臨床診斷和治療提供新的理論基礎(chǔ)和作用靶點。