賀琪，盛丹丹，陳 澤，周 敏，周 欣，梁紫珊，陳定芳,4，賀福元,4,5,6*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208

3. 中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥炮制與制劑制備工程技術(shù)實驗室，湖南 長沙 410208

5. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥超分子機理與數(shù)理特征化實驗室，湖南 長沙 410208

6. 中藥藥性與藥效國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，湖南 長沙 410208

中藥歸經(jīng)理論最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，歸即歸屬，指藥物作用的歸屬；經(jīng)即人體的臟腑經(jīng)絡(luò)；歸經(jīng)即藥物作用的定位，就是將藥物的作用與人體的臟腑經(jīng)絡(luò)密切聯(lián)系起來，以說明藥物作用對機體某部分的選擇性。因此，利用中藥歸經(jīng)理論可引藥上升、下降、達表、入里，直達病所[1]。肺與大腸通過“立體多維”的經(jīng)絡(luò)循行構(gòu)成表里關(guān)系，其中任何一方功能失調(diào)，都會波及到對方[2]。然這種作用關(guān)系可通過只歸肺經(jīng)中藥成分客體“印跡模板”的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征得到探知，因此展開歸肺和大腸經(jīng)中藥成分的“印跡模板”特征分布分析，對探討肺經(jīng)與大腸經(jīng)的表里關(guān)系具有重大的意義。

人和中藥都是巨復(fù)超分子，各種分子按“印跡模板”形成超分子聚集體[3]。在這個過程中，各種分子通過自組織、自組裝、自識別與自復(fù)制作用逐級形成巨復(fù)超分子，母體必然保留子體的“印跡模板”特征，關(guān)聯(lián)表里內(nèi)外、上下左右形成經(jīng)絡(luò)臟腑[4]。因此，通過探索中藥與人體之間相互匹配的“印跡模板”特征，就有可能闡明中藥歸經(jīng)理論，從而揭示中醫(yī)經(jīng)絡(luò)“印跡模板”物質(zhì)基礎(chǔ)特征。

定量結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系/定量結(jié)構(gòu)-保留時間關(guān)系（quantitative structure-property relationship/quantitative structure-retention relationship，QSPR/QSRR）是運用數(shù)學(xué)統(tǒng)計分析和應(yīng)用化學(xué)理論計算方法，建立數(shù)學(xué)模型來定量地描述和研究有機物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)或保留時間之間的對應(yīng)關(guān)系，已于1977 年開始陸續(xù)在色譜學(xué)中得到應(yīng)用。在缺乏對照品，也沒有可以利用的相對保留時間可參考的情況下，人們希望能通過利用藥物結(jié)構(gòu)參數(shù)或某些容易獲得的物化性能參數(shù)來預(yù)測藥物色譜保留時間，于是建立了QSPR/QSRR 法[5]。該方法同樣可用于中藥成分與人體經(jīng)絡(luò)臟腑作用關(guān)系的研究，解決中藥歸經(jīng)難以闡釋這個問題[6]。由于QSPR/QSRR 可表征中藥成分結(jié)構(gòu)與色譜印跡行為，同樣也能表征中藥成分結(jié)構(gòu)與人體定量作用規(guī)律，可將中藥對人體歸經(jīng)的作用規(guī)律研究轉(zhuǎn)移至體外對色譜學(xué)行為規(guī)律的研究]7-8]，將極大地化簡中藥歸經(jīng)研究的難度。

本研究以全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》為基本標(biāo)準(zhǔn)，從443 味中藥中歸納只歸肺和大腸經(jīng)的11 味藥，分別是番瀉葉、羅漢果、紫蘇子、馬兜鈴、胖大海、苦杏仁、皂莢、金沸草、訶子、石榴皮、松子仁。先對其所含成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行類別分析，并對其中相同成分進行整理、刪減、合并，最終共獲886 種中藥成分。再計算出 0 ～8 階分子連接性指數(shù)（molecular connectivity index，MCI），匯總成各類別的MCI 信息[9]，并與其平均值進行相似度比較，按相似度高低排序獲得歸肺和大腸經(jīng)成分類型和對照品，并對MCI 相似度與對照品保留時間進行線性回歸，獲得印跡參數(shù)；利用QSPR/QSRR 原理對比分析中藥與對照品的印跡參數(shù)重疊，將中藥對人體的歸經(jīng)印跡研究轉(zhuǎn)移至體外的色譜印跡研究，簡化并創(chuàng)立中藥歸經(jīng)體外研究方法，為人體經(jīng)絡(luò)“印跡模板”空間結(jié)構(gòu)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)[10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity UPLC H-Class 系統(tǒng)、四元溶劑泵、自動進樣裝置、在線真空脫氣裝置、PDA 檢測器、Empower 3 色譜工作站、柱溫箱（以上均來自美國沃特世公司）；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市中天儀器科技有限公司）；SHB-IIIA 循環(huán)水式多用真空泵（北京市中興偉業(yè)儀器有限公司）；DZTW 調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；1000C 多功能粉碎機（永康市玖藍五金制品有限公司）；JCS-31002C 電子天平（哈爾濱眾匯衡器有限公司）；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市金城國勝實驗儀器廠）；SB-5200DTD 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

番瀉葉、石榴皮、金沸草、訶子、皂莢、羅漢果、胖大海、苦杏仁及紫蘇子購于湖南長沙高橋中藥材市場，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室石繼連副教授鑒定，均符合《中國藥典》2020 版一部規(guī)定。對照品蘆丁（批號DSTDL001701）、3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-葡萄糖苷（批號DST210420-021）、山柰苷（批號DSTDQ-005101）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號DST200619-075）、大黃素-1-O-葡萄糖苷（批號DST210425-072）、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號DSTDM000801）、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號DST201106-066）均購于湖南長沙玖弘生物科技有限公司，以上對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；乙腈（色譜純，美國TEDIA），甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），甲醇（色譜純，美國TEDIA），無水乙醇（分析純，湖南匯虹試劑有限公司），自制純化水。

2 方法與步驟

2.1 MCI 法

MCI 是由Kier 和Hall 等加以發(fā)展而形成的一種新的拓?fù)浞椒?，最早可以追溯?975 年由Randic提出。其能夠定量描述分子的結(jié)構(gòu)信息[11-12]，如分支、不飽和度、大小、環(huán)和雜原子等，并充分反映分子的連接信息和化學(xué)環(huán)境，是表征分子結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)。MCI 與分子的多種理化性質(zhì)（包括液體沸點、密度、分子極化度、摩爾折射率、分配系數(shù)、有機物的水溶性、立體參數(shù)等）及生物效應(yīng)（酶抑制活性、抗菌活性、麻醉活性、毒性等）有關(guān)[13]。本研究采用自編軟件計算0～8 階MCI。

mXt為m階的MCI；Nm為階數(shù)為m的t類型子圖的數(shù)目；δi為原子i的非原子點價，即與原子i相連接的其他非氫原子數(shù)目；t代表子圖類型

隨著階數(shù)m的增高，mXt表達的結(jié)構(gòu)信息能力亦增強，可獲得m×t的矩陣數(shù)據(jù)信息集。本研究階數(shù)Nm為0～8 階，子圖類型t為8，因此能獲得72個MCI 數(shù)據(jù)信息集。對于本研究中兩兩72 個MCI信息集可按照夾角余弦值計算其相似度。將兩矩陣看作是二維數(shù)組向量，任意矩陣數(shù)組元素aij和bij相似度的公式如下。

2.2 總量統(tǒng)計矩分析法

總量統(tǒng)計矩分析法是指紋圖譜定性、定量分析方法之一，其總量零階矩表示作用強度，可用于定量分析；總量一階矩和總量二階矩表示作用特征，可用于定性分析。本研究基于高效液相色譜理論和統(tǒng)計學(xué)方法，對相關(guān)的中藥成分指紋圖譜應(yīng)用總量統(tǒng)計矩進行評價分析。以零階矩、一階矩、二階矩等參數(shù)對圖譜性質(zhì)進行刻畫，達到定性、定量分析中藥的目的[14]?？偭苛汶A矩（AUCT）即一定總量下曲線的總響應(yīng)面積；總量一階矩（MCRTT）為總量中心矩或總量平均保留時間，用λT表示；總量二階矩（VCRTT）為平均保留時間方差，用σT2表示。其中AUCT可用于定量分析，MCRTT、VCRTT可用于定性分析。本研究將MCI 與HPLC 指紋圖譜結(jié)合，探討歸肺和大腸經(jīng)中藥成分MCI 與中藥指紋圖譜之間的聯(lián)系，再通過總量統(tǒng)計矩進行實驗驗證。

2.3 實驗步驟

2.3.1 歸肺和大腸經(jīng)中藥的收集及其所含成分MCI 的計算 根據(jù)全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》，歸納只歸肺和大腸經(jīng)的中藥。利用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://localhost/ce/index.php）以及MCI 計算軟件完成各成分MCI 的計算，再通過Excel 表的合并計算獲得歸肺和大腸經(jīng)中藥各類成分的平均MCI 以及中藥的總體平均MCI。

2.3.2 供試品溶液的制備 分別取單味藥材番瀉葉、石榴皮、金沸草、訶子、皂莢、羅漢果、胖大海、苦杏仁、紫蘇子約20 g 加入圓底燒瓶，加8 倍量水回流提取2 次，每次1 h，紗網(wǎng)濾過，合并2 次濾液，趁熱抽濾，減壓濃縮至浸膏，分別加適量50%甲醇超聲處理至完全溶解，定容至生藥質(zhì)量濃度為0.5 g/mL，以3000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液過0.22 μm 有機濾膜后置液相色譜儀樣品瓶中，待測。

2.3.3 對照品溶液的制備 分別取蘆丁、3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-葡萄糖苷、山柰苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、大黃素-1-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定1 mg，置棕色量瓶中，加50%甲醇定容至5 mL，分別制成0.2 mg/mL 的對照品溶液，并超聲處理5 min，過0.22 μm 有機濾膜進置液相色譜儀樣品瓶中，待測。

2.3.4 HPLC 測定條件 色譜柱為Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.4%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～20 min，100%～95% A；20～30 min，95%～90% A；30～65 min，90%～75% A；65～70 min，75%～55% A；70～75 min，55%～100% A）。體積流量為1.0 mL/min，進樣量為1 μL，檢測波長為260 nm。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計描述、相似度和線性回歸比較分析樣本間的差異。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分頻次統(tǒng)計及MCI 和相似度的計算

從443 味中藥中歸納只歸肺和大腸經(jīng)的11 味藥，分別是番瀉葉、羅漢果、紫蘇子、馬兜鈴、胖大海、苦杏仁、皂莢、金沸草、訶子、石榴皮、松子仁。歸肺和大腸經(jīng)中藥所含成分種類分布統(tǒng)計如表1 所示。用Xp、Xvp、Xc、Xvc、Xpc、Xvpc、Xch、Xvch 分別代表0～8 階的路徑、點價路徑、簇、點價簇、路徑簇、點價路徑簇、環(huán)、點價環(huán)的不同連接形式的MCI，見圖1，并計算各類成分平均MCI與總體平均MCI 的相似度（圖1 中各圖標(biāo)題后的括號內(nèi)數(shù)值為相似度）。

圖1 中藥各類成分的平均MCI 及總體平均MCIFig. 1 Average molecular connectivity index of various components and overall components in traditional Chinese medicine

表1 歸肺和大腸經(jīng)中藥所含成分類型分布Table 1 Type distribution of compositions contained in traditional Chinese medicine attributed to lung and intestine meridian

3.2 歸肺和大腸經(jīng)中藥成分的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似度

將886個成分MCI與歸肺和大腸經(jīng)的平均MCI逐個進行相似度計算并且進行排序，相似度最高的前10 位成分是旋覆花內(nèi)酯、α-古蕓烯、2(R)-(6-甲氧基-4-喹啉基)-[(2R,4R,5S)-5-乙烯基喹啉-2-基]甲醇、(±)-紫蘇醛、β-欖香烯、4-甲氧基苯乙酮、旋覆花內(nèi)酯A、旋覆花內(nèi)酯B、1,2,3,7-四甲基吲哚、inuviscolide。以上成分多為萜類、苯丙素或生物堿類，對照品不易獲得，很難進行實驗驗證?？紤]到黃酮、蒽醌、鞣質(zhì)類成分平均MCI 相似度均在0.95以上，且主要集中在番瀉葉、訶子、石榴皮中，易從中尋找到適宜的歸肺和大腸經(jīng)成分“印跡模板”表征物質(zhì)。

對表1 中的96 個黃酮、蒽醌、鞣質(zhì)類成分的MCI與其平均MCI 的相似度進行排序，前10 位成分的MCI相似度通過0～8 階MCI 比較的情況分別用Xp、Xvp、Xc、Xvc、Xpc、Xvpc、Xch、Xvch 表示，見圖2。

圖2 黃酮、蒽醌、鞣質(zhì)類成分平均MCI 相似度排名前10 位成分Fig. 2 Average MCI similarity ranked top 10 components in flavonoids, anthraquinone and tannins

4 實驗驗證

4.1 9 味藥材的HPLC 指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩參數(shù)

對番瀉葉、訶子、金沸草、皂莢、紫蘇子、苦杏仁、羅漢果、胖大海、石榴皮9 味歸肺和大腸經(jīng)的中藥（因馬兜鈴為管制中藥，松子仁在《中國藥典》中無收載，二者未采用）按照“2.3.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.3.4”項下色譜條件進樣測定，HPLC 圖譜如圖3 所示。再運用中藥指紋圖譜總量統(tǒng)計矩（相似度）法分析，獲得總量零、一階、二階矩參數(shù)，結(jié)果見表2。

圖3 9 味歸肺和大腸經(jīng)中藥的HPLC 圖譜Fig. 3 HPLC fingerprint of nine traditional Chinese medicines attributed to lung and large intestine meridian

表2 9 味歸肺和大腸經(jīng)中藥的總量統(tǒng)計矩參數(shù)Table 2 Total statistical moment parameters of nine traditional Chinese medicines attributed to lung and large intestine meridian

4.2 7 個對照品的HPLC 圖譜

為準(zhǔn)確建立結(jié)構(gòu)與保留時間的關(guān)系，從而推導(dǎo)出歸肺與大腸經(jīng)的“印跡模板”特征。故在篩選驗證的成分時相似度不能太近，選取排在前50%的成分，建立相似度與保留時間的線性關(guān)系。從黃酮、蒽醌、鞣質(zhì)類成分中選取排名依次為5、8、10、16、40、44、49 的大黃素-1-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-葡萄糖苷、山柰苷、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷。按照“2.3.3”項下方法制備對照品溶液，按照“2.3.4”項下色譜條件測定其HPLC 指紋圖譜，如圖4 所示。圖4 中大黃酚-8-Oβ-D-葡萄糖苷和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的保留時間重疊。大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷保留時間與MCI相似度的相關(guān)性為0.867 3，回歸方程為S＝0.988 4＋1.797×10-4tR，R＝0.866 2（P＜0.01），見表3。提示歸肺和大腸經(jīng)成分的“印跡模板”特征性可用HPLC的保留時間測定。

圖4 7 個對照品的HPLC 圖譜Fig. 4 HPLC fingerprints of seven references substances

表3 7 個對照品的HPLC 保留時間與MCI 相似度的相關(guān)性及平均峰面積Table 3 Correlation between HPLC retention time and MCI similarity and average peak area of seven reference substances

4.3 7 個對照品和9 味藥材總量統(tǒng)計矩比較

按總量統(tǒng)計矩的加合性計算公式獲得7 個對照品與9 味藥材的整體總量統(tǒng)計矩參數(shù)，如表4 所示。二者的一階矩接近，說明7 個成分的整體“印跡模板”印跡作用與9 味歸肺與大腸經(jīng)的成分簇“印跡模板”印跡作用相近，但零階矩、二階矩相差很大，說明二者的成分簇的種類和數(shù)目不同，但7 個成分基本上能表征歸肺和大腸經(jīng)成分簇的“印跡模板”總體特征。

表4 7 個對照品和9 味藥材總量統(tǒng)計矩比較Table 4 Statistical moment comparison of total amount of seven reference substances and nine herbs

5 結(jié)論

本研究篩選出番瀉葉、訶子等11 味歸肺和大腸經(jīng)的中藥，計算出已報道成分的MCI，包括了萜類、黃酮類、苯丙素類、鞣質(zhì)類、甾體類、有機酸類、糖苷類、生物堿類、醌類、其他類886 個成分，再根據(jù)各部位、成分與平均MCI 的相似性確定了前10位成分，多為萜類、苯丙素或生物堿類，其對照品難以獲得，考慮到黃酮、蒽醌、鞣質(zhì)類成分平均MCI相似度均在0.95 以上，且在番瀉葉、訶子、石榴皮中集中分布，故以黃酮、蒽醌、鞣質(zhì)類成分為代表，根據(jù)相似度排序選取蘆丁、山柰苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、大黃素-1-O-β-D-葡萄糖苷、3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷7 個成分作為對照品，其保留時間對MCI 相似度進行回歸，二者相關(guān)系數(shù)為0.866 2（P＜0.01），說明MCI 能很好預(yù)測其印跡行為，各成分與色譜印跡作用存在較好的QSRR 性。7 個對照品按指紋圖譜峰面積得到的總量一、二階統(tǒng)計矩分別為45.48 min、26.39 min2，其15%的區(qū)間為 [44.46 min，46.50 min]。利用總量統(tǒng)計矩法分析9 味藥材的HPLC 圖譜，測得1008 個峰，與查閱到的成分?jǐn)?shù)相近。按指紋峰數(shù)目算得總量統(tǒng)計一、二階矩分別為43.39 min、348.80 min2，其15%的區(qū)間為 [39.70 min，47.08 min]，與7 個對照品的總量統(tǒng)計矩的15%區(qū)間相互重疊，也就是有15%（正常是95%）把握認(rèn)為二者不是一類歸經(jīng)物質(zhì)，反之就有85%（正常是5%）把握認(rèn)為是相同的歸經(jīng)物質(zhì)，即7 個成分化學(xué)結(jié)構(gòu)能85%把握表征歸肺和大腸經(jīng)中藥成分“印記模板”的特征。由于7 個成分的母核分別為蒽醌、黃酮、鞣酸類，因此可以初步判斷歸肺和大腸經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)可用蒽醌類、黃酮類、鞣酸類為“印跡模板”的中藥成分群進行表征。

上述研究表明，MCI 能夠定量描述分子的結(jié)構(gòu)信息，越接近者分子結(jié)構(gòu)越相似，理化性質(zhì)越相近，藥理作用越相似，并可利用QSRR 原理分析色譜印跡行為，并通過色譜學(xué)總量統(tǒng)計矩參數(shù)表征出來，相互進行驗證，這樣可將中藥成分體內(nèi)歸經(jīng)的復(fù)雜問題轉(zhuǎn)變成體外可測的色譜學(xué)印跡行為進行研究，極大地降低了中藥藥性的研究難度。如7 個成分按中藥化學(xué)母核歸屬為蒽醌類、黃酮類、鞣酸類，其母核結(jié)構(gòu)類型迥異，但保留時間卻接近，特別是3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-葡萄糖苷和大黃素-1-O-β-D-葡萄糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同，但其保留時間卻相差不大，因此MCI 是表征中藥成分化學(xué)結(jié)構(gòu)、關(guān)聯(lián)其化學(xué)性質(zhì)、描述其生理藥理和藥劑學(xué)性質(zhì)的重要方法，若與QSPR/QSRR 結(jié)合，將構(gòu)建起中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)、藥性、藥理研究的重用研究方法與工具。

前期本團隊創(chuàng)立了中醫(yī)藥超分子“氣析”理論，以中藥歸經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究為重要內(nèi)容，若結(jié)合MCI，從中藥物質(zhì)結(jié)構(gòu)定量表征入手，先系統(tǒng)描述所歸經(jīng)成分的分子結(jié)構(gòu)拓?fù)涮卣鳎瑢ふ业交境煞纸Y(jié)構(gòu)，再與各類成分平均MCI 比較其相似性，從QSPR/QSRR 計算的角度獲得中藥歸經(jīng)信息，再進行色譜印跡行為驗證，就可初步確定中藥歸經(jīng)的客體分子特征，再運用超分子的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，最終可揭示中藥歸經(jīng)的主客體分子結(jié)構(gòu)全貌，實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突