葉銀霜 徐佳微 王琳 李鐵山

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)二科,山東 青島 266003)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是臨床上常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)退變疾病,也是導(dǎo)致慢性疼痛最常見(jiàn)的原因之一[1］。疼痛會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,是OA患者就診的主要原因[2］。目前,OA疼痛的治療手段包括藥物和非藥物治療,如運(yùn)動(dòng)療法與非甾體抗炎藥物和鎮(zhèn)痛藥治療等[3］,但是這些治療僅可以暫時(shí)緩解或減輕患者的疼痛[4］。OA疼痛的機(jī)制十分復(fù)雜,研究發(fā)現(xiàn),OA慢性疼痛不僅是由局部關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病變引起,可能還與中樞神經(jīng)回路的變化有關(guān)[5］。經(jīng)顱直流電刺激(tDCS)是一種中樞調(diào)控技術(shù),具有非侵入性、無(wú)痛性和相對(duì)安全的特點(diǎn),在臨床應(yīng)用于諸如重度抑郁癥等多種疾病的治療[6］。tDCS將微弱直流電通過(guò)兩個(gè)電極從顱骨傳遞到大腦皮質(zhì),調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的興奮性,使神經(jīng)組織極化[7］,從而發(fā)揮治療慢性疼痛的作用[8］。研究顯示,tDCS治療膝部OA患者時(shí),能有效緩解患者的慢性疼痛[9］,但其機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)分析tDCS對(duì)OA慢性疼痛大鼠的疼痛行為及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的影響,進(jìn)一步探討tDCS對(duì)OA慢性疼痛的治療效果及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑

健康雄性SD大鼠36只,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。熱輻射刺激儀(山東益延科技有限公司),Von Frey Hair測(cè)試儀(North Coast公司,美國(guó)),單碘乙酸鈉(MIA,Sigma公司,美國(guó)),兔抗大鼠BDNF抗體(Abcam公司,美國(guó)),GAPDH(上海泊灣生物科技有限公司),HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP公司,美國(guó))。

1.2 大鼠的分組和處理

所有大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、MIA組、tDCS組和假tDCS組,每組9只。假手術(shù)組大鼠于左膝膝下韌帶處向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射60 μL的生理鹽水;MIA組、tDCS組和假tDCS組大鼠于左膝膝下韌帶處向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射60 μL濃度80 g/L的MIA,構(gòu)建OA慢性疼痛模型[10］。在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)常規(guī)飼養(yǎng)21 d。在MIA注射后第21天時(shí),將tDCS儀器的陰極用膠帶固定于tDCS組大鼠雙眼外側(cè)角的中點(diǎn)(眶上區(qū)域),陽(yáng)極固定于兩耳之間(大鼠的頂葉皮質(zhì)),電流輸出設(shè)為恒定0.5 mA,進(jìn)行tDCS治療[11］,每天20 min,連續(xù)8 d[11］;假tDCS組大鼠以同樣的方法固定陰陽(yáng)電極,但無(wú)電流輸出。假手術(shù)組和MIA組大鼠不做任何處理,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 疼痛行為學(xué)測(cè)試

從各組大鼠中隨機(jī)取出6只,分別于治療結(jié)束后第1、2、7天時(shí)進(jìn)行疼痛行為學(xué)測(cè)試。①機(jī)械痛撤足閾值(PWT)測(cè)試:測(cè)試前,所有的大鼠均先放置于底部為金屬網(wǎng)的有機(jī)玻璃罩里適應(yīng)20 min,采用Von Frey Hair測(cè)試儀通過(guò)up-down方法來(lái)進(jìn)行評(píng)估[12］。記錄最終Von Frey Hair值代入專(zhuān)用公式評(píng)估各組大鼠的PWT值。②熱痛閾潛伏期(PWL)測(cè)試:測(cè)試前,所有大鼠均先放置在未加熱的熱輻射刺激儀中適應(yīng)5 min,然后加熱熱輻射刺激儀使其表面維持在恒定溫度(55.0±0.1)℃,大鼠第一次行為反應(yīng)(包括舔腳、跳躍、快速移走爪子)的時(shí)間即為PWL[13］。

1.4 免疫蛋白印跡檢測(cè)

從各組大鼠中隨機(jī)取出3只,于治療結(jié)束后第2天麻醉處死,然后迅速取出中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(PAG)組織,置于RIPA裂解液中冰上裂解30 min,離心取上清液,并置于100 ℃恒溫金屬浴中孵育10 min,制備為蛋白樣品。采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。等量的各組蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入BDNF抗體(1∶1 000)或GAPDH抗體(1∶5 000)于4 ℃下孵育過(guò)夜。第2天,洗膜后加入二抗(1∶5 000)于室溫下孵育2 h。最后,使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ECL試劑對(duì)條帶進(jìn)行顯影,采用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MIA和tDCS對(duì)各組大鼠PWL的影響

重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析結(jié)果顯示,時(shí)間、時(shí)間與分組交互作用對(duì)大鼠PWL均無(wú)明顯影響(P>0.05),分組對(duì)大鼠PWL有明顯影響(F組別=42.72,P<0.01)。組間比較結(jié)果顯示,在治療結(jié)束后第1、2、7天時(shí),各組大鼠的PWL差異均有顯著性(F=11.25～21.48,P<0.01);各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較結(jié)果顯示,MIA組與假手術(shù)組、tDCS組與假tDCS組PWL差異均有顯著性(P<0.01),MIA組與假tDCS組差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 MIA和tDCS對(duì)各組大鼠PWT的影響

重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析結(jié)果顯示,時(shí)間、時(shí)間與分組交互作用對(duì)大鼠的PWT無(wú)明顯影響(P>0.05),分組對(duì)大鼠PWT則有明顯的影響(F組別=330.91,P<0.01)。組間比較顯示,治療結(jié)束后第1、2、7天時(shí),各組大鼠PWT差異均有顯著性(F=54.42～186.40,P<0.01);各時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較結(jié)果顯示,MIA組與假手術(shù)組、tDCS組與假tDCS組的PWT比較差異均有顯著性(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠治療后不同時(shí)間點(diǎn)PWL和PWT比較

2.3 tDCS對(duì)各組大鼠PAG組織中BDNF蛋白表達(dá)水平的影響

免疫蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,在tDCS治療結(jié)束后第2天,假手術(shù)組、MIA組、tDCS組和假tDCS組大鼠PAG組織中BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.12、0.95±0.10、0.68±0.05、1.02±0.03,組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.70,P<0.01)。其中,MIA組與假手術(shù)組、tDCS組與假tDCS組的PAG組織中BDNF蛋白表達(dá)量比較差異有顯著性(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

A:假手術(shù)組,B:MIA組,C:tDCS組,D:假tDCS組

3 討 論

OA是臨床常見(jiàn)的慢性疾病,其引起的疼痛也是導(dǎo)致骨骼肌肉慢性疼痛的原因之一。tDCS作為一種非侵入性的、安全的中樞調(diào)控技術(shù)已應(yīng)用于多種慢性疼痛的治療[8］,但是其鎮(zhèn)痛機(jī)制目前尚未完全闡明。因此進(jìn)一步探究tDCS對(duì)OA慢性疼痛的治療作用及其機(jī)制,對(duì)臨床上應(yīng)用tDCS治療OA慢性疼痛具有重要意義。

目前,已有多種動(dòng)物模型用于研究OA慢性疼痛。其中,關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA是目前研究OA慢性疼痛最常用動(dòng)物模型[14］。研究發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射高劑量MIA(4.8 mg)會(huì)導(dǎo)致大鼠的后爪支撐力分布不對(duì)稱(chēng)和持續(xù)性疼痛[10］,這與晚期OA患者持續(xù)性慢性疼痛的臨床表現(xiàn)相似。本研究通過(guò)向大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射高劑量MIA建立OA慢性疼痛模型,并在MIA注射后第21天時(shí),使用tDCS進(jìn)行為期8 d的治療,在治療結(jié)束后第1、2、7天時(shí)對(duì)各組大鼠的疼痛行為學(xué)進(jìn)行測(cè)試。既往研究表明,PWL測(cè)試主要評(píng)估大鼠的熱痛閾來(lái)反映脊髓的感覺(jué)整合能力[15］;而PWT測(cè)試主要通過(guò)評(píng)估大鼠機(jī)械痛閾來(lái)反映脊髓反射情況,以及更復(fù)雜的脊髓上感覺(jué)整合能力[16］。本研究疼痛行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,MIA組大鼠的PWL和PWT均明顯降低;與假tDCS組相比,tDCS組大鼠的PWL以及PWT在治療結(jié)束后第1天就出現(xiàn)明顯升高,并且在治療結(jié)束后第7天仍明顯升高。這表明,tDCS可以有效緩解MIA大鼠誘導(dǎo)的OA慢性疼痛,并且其治療作用可以持續(xù)到治療結(jié)束后第7天。

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的重要成員,是重要的疼痛調(diào)節(jié)劑,并在慢性疼痛的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用[17］。在坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型中,過(guò)表達(dá)的BDNF可以通過(guò)酪氨酸激酶B受體(TrkB)信號(hào)在脊髓中產(chǎn)生持久的神經(jīng)興奮性變化,并參與痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生和維持[18］。行為藥理學(xué)和電生理學(xué)研究示,PAG神經(jīng)元中BDNF可以通過(guò)PAG-RVM通路在腦干的疼痛下行調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[19］。PAG是疼痛下行調(diào)節(jié)通路的關(guān)鍵部位,在疼痛調(diào)節(jié)通路中起重要作用。本研究的免疫印跡結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,MIA組大鼠PAG組織中BDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高,提示PAG組織中BDNF過(guò)表達(dá)可能是MIA誘導(dǎo)的OA大鼠慢性疼痛的發(fā)生原因之一。

既往研究表明,tDCS可以通過(guò)調(diào)節(jié)自發(fā)神經(jīng)元的放電,使神經(jīng)元的興奮性發(fā)生改變,從而緩解疼痛[20］。而B(niǎo)DNF在中樞神經(jīng)元超興奮性的啟動(dòng)和維持方面發(fā)揮著重要作用[21-22］。在持續(xù)性炎性疼痛大鼠模型中,中縫大核中的BDNF表達(dá)上調(diào),上調(diào)的BDNF會(huì)使該部位膜上氯化鉀共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)減少,致使細(xì)胞內(nèi)Cl-含量增加,γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的抑制作用減弱,最終導(dǎo)致神經(jīng)元過(guò)度興奮及疼痛敏化的發(fā)生[23］。有研究顯示,tDCS的作用不僅局限于電極正下方的大腦皮質(zhì)區(qū)域,還可產(chǎn)生更廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用,包括扣帶回、丘腦以及PAG等區(qū)域[16］。SOUZA等[24］研究發(fā)現(xiàn),tDCS的抗痛覺(jué)過(guò)敏作用與腦干的疼痛下行抑制通路有關(guān)。

此外,SCARABELOT等[20］還發(fā)現(xiàn),tDCS可以調(diào)節(jié)由口面部慢性疼痛誘導(dǎo)的神經(jīng)可塑性改變,減少腦干中BDNF和TrkB的相互作用,以緩解疼痛。但PAG組織中BDNF在tDCS鎮(zhèn)痛中的作用,目前較少有研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)連續(xù)8 d的tDCS治療,tDCS組與假tDCS組比較,大鼠PAG組織中BDNF的表達(dá)水平顯著降低。這表明tDCS可能是通過(guò)下調(diào)MIA誘導(dǎo)的OA慢性疼痛大鼠的PAG組織中BDNF表達(dá)水平,降低PAG組織中神經(jīng)元興奮性,從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述,tDCS能夠有效緩解MIA大鼠誘導(dǎo)的OA慢性疼痛,并且治療作用可以持續(xù)到治療結(jié)束后第7天。此外,其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與下調(diào)大鼠的PAG組織中BDNF表達(dá),降低PAG組織中神經(jīng)元興奮性有關(guān)系。但是tDCS在下調(diào)PAG組織中BDNF表達(dá)后是如何降低PAG組織中神經(jīng)元興奮性來(lái)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的,還需要進(jìn)一步的研究確定。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)NO.20210820-SD6420211114067)。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定進(jìn)行。

作者聲明：葉銀霜、李鐵山參與了研究設(shè)計(jì);葉銀霜、徐佳微、王琳參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。