張萌 張雨彤 王雪松 王巖

摘要：為探索酶法改性玉米粉技術，得到纖維素酶水解玉米粉的最佳酶解條件，以新鮮玉米粉為原料，研究酶濃度、酶解溫度、酶解pH、酶解時間對還原糖含量的影響。通過單因素實驗和響應面實驗使最適酶解條件更優(yōu)質，并通過掃描電鏡比較微觀結構的變化。經(jīng)研究，纖維素酶酶解玉米粉最適酶解條件為酶解pH 5.31，酶解溫度52.04 ℃，酶解時間4.28 h，纖維素酶濃度0.77％，此條件下還原糖含量為93.605 mg/mL。掃描電鏡結果表明，纖維素酶酶解玉米粉，使玉米蛋白質和淀粉結合松散，結構更易于被破壞。該結果可為玉米粉的進一步改性提供基礎原料，并對酶法改性玉米粉技術提供理論基礎。

關鍵詞：玉米粉；纖維素酶；響應面法；改性；還原糖

中圖分類號：TS213.4? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）04-0120-07

Abstract： In order to explore the technology of enzymatic hydrolysis modification of corn flour and obtain the optimum enzymatic hydrolysis conditions of corn flour hydrolyzed by cellulase， with fresh corn flour as the raw material， the effects of enzyme concentration， enzymatic hydrolysis temperature， enzymatic hydrolysis pH and enzymatic hydrolysis time on the content of reducing sugar are studied.The optimum enzymatic hydrolysis conditions are made better by single factor experiment and response surface experiment， and the changes of microstructure are compared by scanning electron microscope.The results show that the optimal conditions for enzymatic hydrolysis of corn flour by cellulase are pH 5.31， enzymatic hydrolysis temperature 52.04 ℃， enzymatic hydrolysis time 4.28 h and cellulase concentration 0.77%. The reducing sugar content under these conditions is 93.605 mg/mL. Scanning electron microscope results show that the enzymatic hydrolysis of corn flour by cellulase makes the combination of corn protein and starch loose and the structure more easily to destroy. This result can provide basic raw materials for the further modification of corn flour and theoretical basis for the technology of enzymatic hydrolysis modification of corn flour.

Key words： corn flour; cellulase; response surface method; modification; reducing sugar

我國玉米的生產(chǎn)量和消費量均居世界前列[1-2]。在我國糧食產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展中，玉米精深加工業(yè)占有重要地位，深加工產(chǎn)品主要集中在玉米淀粉、燃料、動物飼料等方面[3-5]。玉米精深加工業(yè)快速發(fā)展的同時，也存在產(chǎn)業(yè)鏈延伸不足、深加工價值高、功能性關鍵技術缺乏等制約優(yōu)質發(fā)展的瓶頸[6]。

鑒于玉米直接作為食品僅占其產(chǎn)量的5%這一客觀問題，從玉米粉微觀結構著手，通過玉米粉改性技術使玉米在食品中的應用范圍擴大，并進行玉米主食工業(yè)化開發(fā)，是對玉米深加工產(chǎn)業(yè)有利的補充和延展[7-9]。 在主食化開發(fā)過程中，由于玉米粉中的蛋白質、淀粉、營養(yǎng)組成和內部結構特性，使玉米粉的食用品質不盡如人意。為了提高玉米粉的加工和食用品質，Graham等 [10]利用物理法、化學法和生物法等手段進行了不同方式的研究，其中生物法對玉米粉改性是目前報道的效果最好且最常用的方法[11-12]。

李姝睿等[13]選擇枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）胞外酶對玉米淀粉進行改性研究，經(jīng)過研究得出，一方面，經(jīng)酶改性后淀粉顆粒表面有明顯的酶作用孔隙，但淀粉顆粒的晶型沒有改變。另一方面，酶的作用會對玉米粉中的淀粉、蛋白質等主要成分產(chǎn)生影響，但這些變化會導致玉米粉的食用品質和加工品質發(fā)生變化，其產(chǎn)品還需要進一步研究。

纖維素作為植物細胞壁的主要成分，占玉米粉總質量的10%左右。其化學性質不活潑，結構單元的分子間力極強，由于分子內氫鍵的存在，使本就相連的糖苷鍵無法旋轉，進而使纖維素的剛性顯著增強[14-15]。纖維素的存在會直接影響玉米粉的改性加工過程，阻礙酶與淀粉和蛋白質在空間上的接觸幾率，從而影響主食產(chǎn)品制作過程和產(chǎn)品品質[16-18]。

本實驗針對纖維素酶存在影響玉米粉改性過程、影響消化吸收的問題，選擇纖維素酶，部分降解玉米粉中纖維素，通過單因素實驗，以還原糖量的變化為指標，研究各因素對玉米粉還原糖含量的影響，然后通過設計響應面實驗對纖維素酶酶解玉米粉的最佳工藝條件進行確定，研究結果為進一步優(yōu)化酶法改性玉米粉的微觀結構提供了參考，為玉米粉進一步加工利用提供了原料。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

精制玉米粉：齊齊哈爾市恒昌玉米種植專業(yè)合作社；纖維素酶：南寧東恒華道生物科技有限責任公司；食用堿：市售。

鹽酸：天津市富宇精細化工有限公司；氫氧化鈉：天津市天力化學試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸：國藥集團化學試劑有限公司；無水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚：天津市凱通化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設備

722S可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司； CT-C-IA熱風循環(huán)烘箱 常州市佳騰干燥制粒設備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市榮華儀器制造有限公司；FE28 pH計 梅特勒托利多公司；臺式微量高速離心機 華日機械有限公司；攪拌機 日本日立株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶改性玉米粉的方法

將100 g玉米粉與300 mL蒸餾水混合均勻，放入一定溫度的水浴鍋里，用攪拌器進行攪拌，待攪拌平穩(wěn)后，調到一定pH 值，加入酶，每隔30 min調到一定的pH取樣，離心，取1 mL上清液，加入3 mL DNS（3，5-二硝基水楊酸溶液），100 ℃水浴15 min，在550 nm處測定吸光值[19-20]。

1.3.2 單因素實驗

在纖維素酶酶解玉米粉的工藝條件下，固定酶解pH為7，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為2.5 h，酶濃度為0.1%（質量比），研究各因素對還原糖含量的影響。

1.3.2.1 酶解時間對還原糖含量的影響

以酶解pH為7，酶解溫度為50 ℃，酶濃度為0.1%（質量比），研究酶解時間（1～4 h）對還原糖含量的影響。

1.3.2.2 酶解溫度對產(chǎn)生還原糖含量的影響

以酶解pH為7，酶濃度為0.1%（質量比），酶解時間為2.5 h，研究酶解溫度（30～70 ℃）對還原糖含量的影響。

1.3.2.3 酶解pH對還原糖含量的影響

以酶解溫度為50 ℃，酶濃度為0.1%（質量比），酶解時間為2.5 h，研究酶解pH（3～7）對還原糖含量的影響。

1.3.2.4 酶濃度對還原糖含量的影響

以酶解pH為7，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為2.5 h，研究酶濃度0.1%～1.0% （質量比）對還原糖含量的影響。

1.3.3 響應面實驗

在采用單因素實驗的同時，運用Design Expert 8.0.6軟件，基于 Box-Behnken設計原理，以A（酶解時間）、B（酶濃度）、C（酶解溫度）、D（酶解pH）為自變量，以還原糖含量為響應值，設計了四因素三水平的響應面優(yōu)化實驗，具體的實驗因素和水平設計見表1。

1.4 酶改性玉米粉微觀形貌觀察

用導電膠帶將適量的待測玉米粉粘貼在樣品臺后，置于掃描電子顯微鏡的載物臺上，并不斷放大至500，1 500，2 000，3 000倍，對樣品的微觀結構進行觀察。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 酶解時間對玉米粉還原糖含量的影響

由圖1可知，隨著酶解時間的增加，還原糖含量呈上升趨勢。當酶解時間為0～2 h時，還原糖含量穩(wěn)定增加，2～2.5 h增加較快，但4 h時還原糖含量與2.5 h時還原糖含量相差不大，可能是由于底物濃度是一定的，所以在2.5 h時底物已經(jīng)基本水解完全，從實際生產(chǎn)中的經(jīng)濟效益方面考慮，選定酶解時間為2.5 h進行下一步實驗[21]。

2.1.2 酶濃度對玉米粉還原糖含量的影響

由圖2可知，隨著纖維素酶濃度的增加，還原糖含量也逐漸增加，當纖維素酶的添加濃度為0.1%～0.75%時，還原糖含量緩慢增加，從0.75%開始急速增加，酶濃度達到1.0％時，還原糖含量最高。一方面可能是由于酶的濃度越高，可以酶解出更多的還原糖；另一方面可能是由于水解時間過長，淀粉糊化導致總糖含量升高。當纖維素酶濃度為0.1%時，還原糖含量相對較高。根據(jù)在實際生產(chǎn)中節(jié)約成本的原則，選擇0.1%的酶濃度進行下一步實驗[22]。

2.1.3 酶解溫度對玉米粉還原糖含量的影響

酶的催化效率會受溫度變化的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，還原糖含量呈先升后降的趨勢。還原糖含量最高時的溫度為60 ℃。這是因為纖維素酶的活性會隨著溫度的降低而受到抑制，溫度升高到一定程度會導致酶失活，所以得到還原糖量很少，表明溫度對酶具有雙重作用[23]。所以，選擇酶解溫度為50 ℃進行下一步實驗。

2.1.4 酶解pH對玉米粉還原糖含量的影響

pH會影響纖維素酶的活性，pH過酸或者過堿都可能導致纖維素酶的活性降低。

由圖4可知，隨著pH的增加，還原糖含量出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，達到最大值時的pH值為6。本次實驗所確定的最佳pH為6[24]。

2.2 響應面優(yōu)化設計及結果分析

2.2.1? 響應面設計實驗與結果

以A（酶解時間）、B（酶濃度）、C（酶解溫度）、D（酶解pH）為自變量，以產(chǎn)生的還原糖含量為響應值，設計了四因素三水平的響應面優(yōu)化實驗共29組。具體實驗設計及結果見表2[25-26]。

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

運用Design Expert 8.0.6軟件對響應面檢驗結果進行回歸擬合，得到以A（酶解時間）、B（酶濃度）、C（酶解溫度）、D（酶解pH）為自變量，以產(chǎn)生的還原糖含量Y為響應值的二次多項回歸方程：

Y=-435.031 04+32.383 62A+130.737 89B+74.954 93C+8.032 61×11.539 33AB-0.395 64AC-0.126 88AD-4.476 22BC-0.196 89BD-1.624 00E-0.03×CD-3.830 05A2-94.557 61B2-6.494 95C2-0.070 464D2。

回歸模型的方差分析見表3。

由表3可知，該模型的F值為15.65，P值＜0.000 1，表示該模型差異極顯著；失擬項的P值=0.156 9>0.05，不顯著，表示回歸模型可以接受；模型中B、A2、B2、C2，D2對還原糖含量的影響極顯著，A、D、AB對還原糖含量的影響顯著，C、AC、AD、BC、BD、CD對還原糖含量的影響不顯著。根據(jù)F值和P值，各因素對還原糖含量的影響大小為酶濃度＞酶解pH＞酶解時間＞酶解溫度。模型決定系數(shù)R2=0.939 9，該模型可用于分析和預測由纖維素酶酶解玉米粉產(chǎn)生的還原糖。

2.2.3 響應面分析

由圖5可知，時間不變，還原糖含量隨著酶濃度的增加呈先升后降的趨勢；當酶濃度恒定時，時間在1～6 h范圍內變化，隨著時間的延長，還原糖含量逐漸增加，當時間達到一定值時，還原糖含量趨于平緩且有下降趨勢。

由圖6可知，時間不變，隨著pH值的逐步增加，還原糖含量逐步增加，當pH值達到一定值時，還原糖含量開始下降，這是由于pH會影響纖維素酶的活性，纖維素酶在中性或是偏堿性的溶液中有更好的溶解性，pH過酸或者過堿都可能導致纖維素酶的活性降低；當pH值不變時，時間在1～6 h范圍內變化，隨著時間的延長，還原糖含量隨之增加，而當時間達到一定值時，還原糖含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢。

由圖7可知，時間不變，隨著溫度的升高，還原糖含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，這是由于溫度過低會抑制纖維素酶活性，溫度過高會導致酶失活。當溫度不變時，延長時間，還原糖含量升高，當達到一定時間時，還原糖含量趨于緩慢增加，并有下降趨勢。

由圖8可知，酶濃度一定時，隨著pH值的逐漸增加，還原糖含量逐漸增加，當pH值達到一定值時，還原糖含量開始下降；當pH值不變時，酶濃度在0.1%～1.0%范圍內變化，升高纖維素酶濃度的同時，還原糖含量也逐漸增加?？赡苁怯捎诿傅臐舛仍礁?，可以酶解出更多的還原糖，還可能是由于水解時間過長，淀粉糊化導致總糖含量升高。

由圖9可知，當溫度恒定時，隨著酶濃度的逐漸增加，還原糖含量逐漸增加，當酶濃度恒定時，溫度在30～80 ℃范圍內變化，還原糖含量隨溫度的升高而明顯增加，當溫度達到一定值時，還原糖含量下降趨勢十分明顯。

由圖10可知，溫度一定時，隨著pH值的逐步增加，還原糖含量逐步增加，當pH值達到一定值時，還原糖含量呈下降趨勢；當pH值不變，溫度在30～80 ℃范圍內變化，隨著溫度的升高，還原糖含量也逐漸增加，溫度達到一定值時，還原糖含量呈下降趨勢。

由圖5～圖10可知，酶濃度與酶解時間的交互作用對還原糖含量的影響較大，其中對還原糖含量影響最大的是酶濃度，曲線較陡，其次是酶解pH、酶解時間和酶解溫度，這與方差分析的結果一致。

2.2.4 最佳工藝驗證實驗

根據(jù)響應面優(yōu)化測試產(chǎn)生最佳條件：酶解pH 5.31，酶解溫度52.04 ℃，酶解時間4.28 h。纖維素酶的濃度為0.77％，做一組驗證實驗，將實驗結果與優(yōu)化實驗預測的最佳還原糖含量對比。以上述最佳條件實際測得還原糖含量為93.605 mg/mL，模型預測值為94.289 mg/mL，誤差為0.7%，實驗結果準確，說明該模型能夠較好地預測還原糖含量。

2.3 酶改性對玉米粉微觀形態(tài)的影響

由圖11和圖12可知，玉米中的纖維素會減弱外界條件對內部結構的影響，在纖維素酶處理后淀粉和蛋白質的結合體明顯出現(xiàn)松散和形態(tài)變化。原玉米粉粒徑較大，大小差異顯著，質地緊密，無明顯裂紋和溝壑，較小顆粒存在少量微小孔洞，這是由于玉米粉中蛋白質和淀粉的緊密結合造成的，經(jīng)纖維素酶處理之后，玉米粉表面出現(xiàn)明顯的溝壑和裂紋，可能是由于在纖維素處理后，改變了玉米粉中蛋白質和淀粉的結合方式，促進了淀粉的溶脹。仍呈現(xiàn)不規(guī)則的立體結構，較大粒徑玉米粉數(shù)量下降，大顆粒玉米粉坍塌成小顆粒，且較小顆粒表面孔洞數(shù)量明顯高于原玉米粉。

3 討論

玉米曾經(jīng)一度是我國民眾重要的食物來源，然而伴隨著國民經(jīng)濟的持續(xù)發(fā)展，人們對待食品方面的要求更加嚴格，玉米的加工水平以及食用效果差等讓玉米食品漸漸離開人們的主食桌?，F(xiàn)階段，依托科技含量更高的現(xiàn)代加工手段來達到改善口感、增強品質的效果是實現(xiàn)玉米深加工研究工作的重難點。

現(xiàn)階段玉米粉的生物改性主要是依靠微生物發(fā)酵或者是生物酶水解的方式對玉米粉內的分子結構實現(xiàn)修飾處理，進而使得玉米粉的黏性以及保水力等特性得以優(yōu)化。王景會等采用生物酶對玉米粉進行修飾改性，發(fā)現(xiàn)改性可減少玉米粉中的總淀粉和蛋白含量，增加溶解度和直鏈淀粉含量，從而改善玉米面團的品質。田益玲等研究表明，當葡萄糖氧化酶濃度為80 mg/kg時，25 ℃浸泡6 h可以使玉米粉的品質得到提高。王富盛等采用復合酶對玉米粉進行改性后發(fā)現(xiàn)，單一酶對玉米粉的改性程度有限，多酶復合改性可以改善玉米粉的黏彈性和延展性。

雖然和多種酶復合水解玉米粉的結果相比會有差距，但在玉米粉加工過程中，經(jīng)常會忽視纖維素對玉米粉加工利用的影響，所以本實驗以還原糖含量為指標，通過單因素實驗和響應面實驗優(yōu)化纖維素酶水解玉米粉關鍵工藝條件，最終確定其酶解工藝條件。

4 結論

利用響應面法對纖維素酶酶解玉米粉的工藝條件進行優(yōu)化，響應面實驗確定的最佳條件：酶解pH為5.31，酶解溫度為52.04 ℃，酶解時間為4.28 h，纖維素酶濃度為0.77％。驗證實驗得到的還原糖含量為93.605 mg/mL，模型預測值為94.289 mg/mL，相對誤差為0.7%，酶解效果較好。通過纖維素酶對玉米粉進行改性，改善玉米粉的結構，從而使玉米粉微觀結構發(fā)生變化，使玉米粉中的淀粉和蛋白質等成分充分暴露，更易受到外界條件的影響，為復合酶改性玉米粉提供了原料，有利于玉米粉的應用。但未考慮到加熱條件是否會對還原糖的含量造成一定的影響，以及淀粉糊化對玉米粉的結構會不會造成影響。由于玉米中纖維素含量較少，多數(shù)學者可能會忽視纖維素對玉米粉加工的影響。采用纖維素酶將玉米粉中的纖維素降解，為玉米粉加工提供了一定的數(shù)據(jù)參考。

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