周金劍,楊 康

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院:1.麻醉科,2.泌尿外科,湖北武漢 430061)

腎缺血再灌注 (ischemia reperfusion,I/R)損傷是指腎組織短暫缺血后,恢復(fù)血供導(dǎo)致腎臟損傷程度加重的一種病理生理現(xiàn)象,臨床中常見于腎部分切除以及腎移植等過程。腎 I/R損傷是腎小管和炎癥細(xì)胞等多因素相互作用的炎癥反應(yīng)[1]。調(diào)控核因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)作為一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在體內(nèi)主要參與調(diào)控炎癥反應(yīng)[2]。當(dāng)腎臟發(fā)生I/R時(shí),NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白P65將進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,并促進(jìn)炎癥因子高表達(dá),參與調(diào)控炎癥反應(yīng)[2]。

香葉木素(3’,5,7-三羥基-4’-甲氧基黃酮)是一種從柑橘葉或橄欖葉中提取并抑制人CYP1A酶活力的天然黃酮類化合物,具有抑制腫瘤增殖、抗氧化應(yīng)激的作用[3]。我國學(xué)者構(gòu)建肥厚性心肌病小鼠模型,利用不同濃度香葉木素喂養(yǎng)小鼠,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)香葉木素通過激活P62/keap1/Nrf2信號(hào)通路改善小鼠壓力超負(fù)荷致使的心臟肥大[3]。然而,香葉木素對(duì)腎I/R誘導(dǎo)急性腎損傷的作用和機(jī)制尚未完全闡明。在本研究中,筆者旨在探索香葉木素是否可以改善腎I/R對(duì)小鼠腎損傷的程度,并從動(dòng)物水平探索香葉木素的保護(hù)作用以及其潛在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45只(7～9周齡,20～25 g)雄性BALB/c大鼠購自北京維通利華責(zé)任有限公司,動(dòng)物飼養(yǎng)于恒溫、恒濕SPF級(jí)動(dòng)物房。本研究得到武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),動(dòng)物處置方法均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范。

1.2 分組及處理將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組,n=15)、腎I/R組(I/R組,n=15),香葉木素治療組(Dio組,n=15)。使用滅菌生理鹽水稀釋香葉木素,香葉木素治療組小鼠造模14 d前開始給藥(1 mg/kg),連續(xù)給藥14 d,Sham組和I/R組使用滅菌的生理鹽水作對(duì)照處理。14 d治療后,對(duì)腎I/R組和香葉木素治療組小鼠進(jìn)行腎 I/R模型造模。

1.3 I/R模型的建立術(shù)前1 d小鼠禁食,不禁水。用體積分?jǐn)?shù)為5%的戊巴比妥注射液采用腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠,待小鼠無法自我爬行時(shí),分別剪去雙側(cè)背部毛發(fā),縱向切開皮膚,分離筋膜、肌肉,暴露雙側(cè)腎蒂。雙側(cè)腎臟用無損傷顯微動(dòng)脈夾夾閉,30 min后恢復(fù)血供,逐層縫合切口,分別于術(shù)后48 h取材。從下腔靜脈取血,利用心室生理鹽水灌流至腎臟,待腎臟變白后腎臟取材。小心游離腎蒂,腎臟置于冰上,快速去除包膜,一半行多聚甲醛固定用于組織形態(tài)學(xué)染色,另一半速凍至液氮,轉(zhuǎn)移至深低溫冰箱,用于蛋白及分子生物學(xué)檢測。

1.4 腎功能檢測取小鼠眼球血,使用尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(creatinine,Cr)檢測試劑盒(上海,速徠生物科技有限公司)按照廠家說明書,檢測小鼠體內(nèi)BUN和Cr水平變化。

1.5 HE染色將小鼠腎組織切片放入二甲苯脫蠟,再依次經(jīng)梯度酒精復(fù)水,將其放入蘇木精中染色2 min,立即用流水沖洗30 min去除浮色并藍(lán)化,復(fù)染完成后,將切片依次放入梯度酒精中脫水,最后用二甲苯透明,中性樹膠封片,晾干后在顯微鏡(400倍)觀察并拍照。每只小鼠標(biāo)本獲取5～8個(gè)視野,根據(jù)每個(gè)視野腎小管上皮細(xì)胞擴(kuò)張程度,紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤范圍進(jìn)行腎小管損傷程度評(píng)分(0～4分)。1分:損傷視野<25%;2分:損傷視野<50%;3分:損傷視野<75%;4分:損傷視野>75%。邀請(qǐng)2位病理專業(yè)研究人員,每組小鼠隨機(jī)抽取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 免疫組化染色將小鼠腎組織切片浸潤二甲苯脫蠟,依次經(jīng)梯度酒精復(fù)水,將pH=6.0的檸檬酸緩沖液在水浴鍋中加熱至95 ℃～100 ℃,然后把切片放入燒杯中,繼續(xù)加熱煮沸20～25 min后取出室溫自然冷卻;使用免疫組化試劑盒(福州,邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)根據(jù)廠家說明書進(jìn)行免疫組化檢測。

1.7 免疫印跡技術(shù)采用RIPA試劑盒(武漢,塞維爾生物科技),根據(jù)說明書提取小鼠腎組織蛋白,采用BCA試劑盒(美國,Thermo Fisher公司)檢測樣本的蛋白濃度后,水煮變性,置于8%～12%的SDS-PAGE凝膠(武漢,塞維爾生物科技)孔中電泳后,轉(zhuǎn)印至PVDF膜(美國,Merck Millipore公司),50 g/L脫脂牛奶封閉1 h,加入特異性一抗4 ℃孵育過夜?；瘜W(xué)發(fā)光底物封閉液(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影液封閉,放置ECL顯影系統(tǒng)中掃描聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)并成像。使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。本研究使用抗體為p-P65抗體(美國,CST公司)。

1.8 實(shí)時(shí)定量免疫熒光技術(shù)(real time qPCR,RT-qPCR)獲取小鼠腎組織,采用核酸檢測儀檢測每組樣品RNA濃度,進(jìn)行PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為PCR模板,使用ABI熒光定量PCR儀檢測系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR,檢測IL-1、IL-6和TNF-α在小鼠腎組織轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化(表1)。

表1 炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和內(nèi)參GAPDH引物序列

2 結(jié) 果

2.1 香葉木素對(duì)小鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響與Sham組小鼠相比,I/R組小鼠血清BUN(圖1A)和Scr(圖1B)的濃度顯著增加,然而給以香葉木素處理后,BUN和Cr指標(biāo)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:尿素氮;B:血肌酐。***與假手術(shù)(Sham)組比較,P<0.001;###與模型(I/R)組比較,P<0.001。圖1 假手術(shù)組、缺血再灌注組和香葉木素組小鼠血清中BUN和Scr含量的比較

2.2 香葉木素對(duì)小鼠腎組織結(jié)構(gòu)的影響為評(píng)估香葉木素對(duì)小鼠腎組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用,我們對(duì)不同組小鼠腎組織切片進(jìn)行HE染色,結(jié)果顯示I/R組與Sham組小鼠腎組織相比,損傷嚴(yán)重,光鏡下腎小管廣泛擴(kuò)張,小管間出現(xiàn)大量紅細(xì)胞,以及炎性細(xì)胞浸潤,而給予香葉木素處理后,能顯著減少小鼠腎組織損傷程度(圖2A);腎損傷評(píng)分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。

A:HE染色(×200),黑色箭頭示正常腎小管,紅色箭頭示損傷腎小管;B:三組小鼠腎小管損傷評(píng)分,***與假手術(shù)(Sham)組比較,P<0.001;###與模型(I/R)組比較,P<0.001;N.D:沒有數(shù)據(jù)。圖2 三組小鼠腎臟HE染色圖及腎小管損傷評(píng)分

2.3 香葉木素對(duì)小鼠腎組織p-P65蛋白表達(dá)的影響P65是NF-κB家族關(guān)鍵分子,P65是否磷酸化是NF-κB信號(hào)通路激活的關(guān)鍵。我們利用免疫組化技術(shù)檢測p-P65表達(dá)變化情況,結(jié)果如圖3A所示,I/R組與假手術(shù)組比較,p-P65表達(dá)量顯著增加,且部分小鼠腎小管細(xì)胞核表達(dá)陽性(圖3A黑色箭頭所示),香葉木素處理后,p-P65表達(dá)量有所降低。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn),I/R組p-P65表達(dá)水平與假手術(shù)組比較顯著增加,而處理組p-P65表達(dá)量降低,灰度值分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B、C)。上述結(jié)果說明香葉木素可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路激活緩解小鼠I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷。

A:免疫組化(×400),黑色箭頭示p-P65陽性腎小管細(xì)胞核;B:Western blot法;C:三組p-P65的表達(dá)柱狀圖,***與假手術(shù)(Sham)組比較,P<0.001;###與模型(I/R)組比較,P<0.001。圖3 三組小鼠腎組織p-P65蛋白表達(dá)

2.4 香葉木素對(duì)小鼠腎組織NF-κB下游炎癥因子的影響NF-κB下游炎癥因子是調(diào)控機(jī)體炎癥的關(guān)鍵因素,我們采用實(shí)時(shí)定量免疫熒光技術(shù)檢測NF-κB下游炎癥因子IL-1、IL-6以及腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)在假手術(shù)組、I/R組和給藥組的表達(dá)水平變化情況(圖4)。I/R損傷組小鼠與假手術(shù)組小鼠相比,IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平顯著上調(diào),但是在腎I/R損傷中香葉木素能夠下調(diào)NF-κB相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。

***與假手術(shù)(Sham)組比較,P<0.001;###與模型(I/R)組比較,P<0.001。圖4 實(shí)時(shí)定量免疫熒光技術(shù)檢測各組小鼠炎癥因子表達(dá)水平柱狀圖

3 討 論

I/R時(shí),腎小管堵塞并擴(kuò)張,炎癥細(xì)胞浸潤介導(dǎo)腎小管細(xì)胞損傷,致使腎小球?yàn)V過率降低、腎單位壞死、腎功能急劇惡化[1,4]。目前由于臨床缺少理想的治療手段緩解腎I/R引起的相關(guān)并發(fā)癥,住院患者死亡率較高,重癥患者死亡率可高達(dá)50%[5]。因此,尋找新的治療手段是解決當(dāng)前困境的關(guān)鍵。

目前,有大量文獻(xiàn)報(bào)道香葉木素在骨肉瘤、動(dòng)脈粥樣硬化和肥胖等多種疾病中產(chǎn)生保護(hù)作用[6-8]。然而目前香葉木素是否能夠保護(hù)小鼠腎I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷以及其潛在的機(jī)制還未見報(bào)道。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示香葉木素處理組小鼠血肌酐及尿素氮較I/R模型組小鼠顯著降低,通過HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),I/R模型組小鼠腎小管擴(kuò)張、缺血,腎小管上皮細(xì)胞損傷以及大量炎性細(xì)胞浸潤,提示腎臟I/R導(dǎo)致腎組織損傷,其中以腎小管損傷為主,然而給藥組小鼠腎小管擴(kuò)張、缺血有所緩解,腎小管上皮細(xì)胞損傷減輕,且腎小管損傷評(píng)分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NF-κB家族P65是調(diào)控炎癥表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其參與調(diào)控炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng),介導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子,在機(jī)體中發(fā)揮重要作用。為探索香葉木素的保護(hù)作用機(jī)制,我們檢測NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子P65磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組小鼠相比,I/R組小鼠p-P65蛋白表達(dá)量顯著增加,然而香葉木素能夠降低p-P65蛋白表達(dá)水平,表明香葉木素可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路磷酸化,對(duì)I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。此外,本研究發(fā)現(xiàn)香葉木素可減少NF-κB信號(hào)通路下游炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平,說明香葉木素能夠抑制小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng),緩解I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷。然而,本研究缺乏相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)一步證明香葉木素與NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系。

綜合本研究結(jié)果,本文證明香葉木素可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路磷酸化以及該信號(hào)通路下游炎癥因子的表達(dá),從而緩解小鼠I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷,預(yù)示香葉木素可能成為一種新的治療急性腎損傷的藥物。