陳海濱,王立姣,趙建軍,譚 超

(河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院:1.泌尿外二科,2.呼吸內(nèi)二科,河北邯鄲 056004)

腎細(xì)胞癌又稱腎腺癌,是一種起源于腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,占全身惡性腫瘤的2%～3%,每年導(dǎo)致全球大約140余萬人死亡[1]。外科手術(shù)一直是治療腎癌的首選方法,但患者常常出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,且腎細(xì)胞癌中有多種耐藥蛋白過度表達(dá),常規(guī)化療收效甚微。近年來,靶向與免疫聯(lián)合治療已成為腎癌領(lǐng)域的研究熱點,但治療后部分患者也將面臨著耐藥問題[2-3]。因此臨床上急需尋求治療腎細(xì)胞癌的新策略。

綠原酸是常見的多酚類化合物,主要存在于金銀花、山銀花、杜仲葉及咖啡豆等天然植物中[4],已被證明具有廣泛的藥理活性,如抗氧化、抗凝血、降血糖、抗病毒等作用[5]。此外,多項研究表明,綠原酸具有抗癌特性。REFOLO等[6]報道綠原酸聯(lián)合瑞戈非尼對人肝細(xì)胞癌有明顯抑制作用。FENG等[7]報道綠原酸對D-半乳糖引起的腎損傷有保護(hù)作用。我們推測綠原酸可能對腎細(xì)胞癌也具有抗腫瘤活性。本研究以腎癌細(xì)胞株A498、769-P為研究對象,觀察綠原酸對腎癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響,并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑人腎癌A498,769-P細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)1640購自美國Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazoIyl tetrazolium,MTT)購自北京索萊寶科技有限公司;BCA檢測試劑盒購自上海捷瑞生物科技有限公;Transwell板購自美國Corning公司;白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒購自美國RD公司;缺氧誘導(dǎo)因子-2α(endothelial PAS domain protein-1,EPAS-1/HIF-2α)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(P65)、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(p-P65)、小鼠抗-IL-1β抗體(anti-IL-1β)均購自美國CA公司;羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;電化學(xué)(electrochemiluminescence or electrogeneraTED CHEMILUMINESCENCE,ECL)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司;熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;實時熒光定量PCR儀購自美國Biosystems公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組[8]人腎癌A498和769-P細(xì)胞分別用RPMI 1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的 FBS和體積分?jǐn)?shù)為1%的青霉素-鏈霉素)于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶消化傳代,待細(xì)胞融合至80%后,加入0 μL綠原酸溶液,作為對照組;加入200 μL綠原酸溶液(含綠原酸1 μmol/L),作為綠原酸組;加入0 μL綠原酸溶液和40 μL小鼠IL-1β抗體(1 μg/μL),作為對照+anti-IL-1β組;加入200 μL綠原酸溶液(含綠原酸1 μmol/L)和40 μL人IL-1β抗體(1 μg/μL),作為綠原酸+anti-IL-1β組。各組細(xì)胞于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力取細(xì)胞采用胰蛋白酶進(jìn)行消化,接種于96孔培養(yǎng)板(1×105個/mL),置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48、72 h。每組設(shè)6個復(fù)孔。實驗結(jié)束前,加入20 μL MTT培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液,于室溫加入DMSO振蕩10 min溶解結(jié)晶,采用酶標(biāo)儀檢測波長570 nm吸光度值,實驗重復(fù)3次,以3次的平均值作為該項的結(jié)果值。

1.4 Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲能力取細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,PBS洗滌2次。用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/mL,取100 μL細(xì)胞懸液于Transwell小室上層,將無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(400 μL)加入Transwell小室上層,而RPMI 1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS)加入下層。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取出小室,用棉簽將上室底部基底膜上的細(xì)胞刮除,室溫下用40 g/L多聚甲醛固定10 min,結(jié)晶紫染色30 min。倒置顯微鏡下選取5個視野拍照,統(tǒng)計穿膜細(xì)胞數(shù),實驗重復(fù)3次,以3次的平均值作為該項的結(jié)果值。

1.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力取細(xì)胞,接種于6孔板內(nèi)(密度4×105個/mL),當(dāng)細(xì)胞單層長滿時,用移液器槍頭沿孔板底部劃一條直線。倒置顯微鏡下于0 h和24 h拍照記錄,并計算細(xì)胞遷移率。實驗重復(fù)3次,以3次的平均值作為該項的結(jié)果值。

1.6 ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-1β水平取細(xì)胞,收集細(xì)胞上層培養(yǎng)基,離心將上清轉(zhuǎn)入離心管中備用。依據(jù)酶聯(lián)免疫(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書操作,檢測細(xì)胞上清液中IL-1β水平。

1.7 實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)法檢測細(xì)胞 EPAS-1 mRNA表達(dá)收集細(xì)胞,用Trizol提取總 RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 cDNA合成,反應(yīng)條件如下:預(yù)變性95 ℃、5 min,95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,74 ℃延伸7 min,循環(huán)40次。實時熒光使用7900HT Fast Real-Time檢測。以GAPDH為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量,每組細(xì)胞測定3次,以3次的平均值作為該項的結(jié)果值。

1.8 Western blot檢測細(xì)胞EPAS-1及AKT/P65信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)收集細(xì)胞,PBS清洗,加RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑,離心收集蛋白。用BCA法測定總蛋白量,取25 μg蛋白上樣,采用聚丙烯酰胺凝膠(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳分離蛋白,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用含25 g/L脫脂奶粉封閉1 h,分別加入EPAS-1(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶2 000)、P65(1∶500)和p-P65(1∶1000)一抗,室溫孵育過夜,洗滌,再加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育1 h,經(jīng)ECL顯色后曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1 綠原酸對A498、769-P細(xì)胞增殖能力的影響用綠原酸刺激A498、769-P細(xì)胞24、48、72 h后,與對照組比較,綠原酸組可顯著抑制A498、769-P細(xì)胞的增殖,且呈時間依賴性(P<0.05,表1)。

表1 綠原酸對人腎癌A498和769-P細(xì)胞增殖能力的影響inparagraph

2.2 綠原酸對A498、769-P細(xì)胞侵襲能力的影響在人腎癌A498細(xì)胞中,對照組和綠原酸組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(197.9±12.2)個/視野、(50.4±8.3)個/視野,與對照組比較,綠原酸組穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01)。

在人腎癌769-P細(xì)胞中,對照組和綠原酸組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(145.7±11.4)個/視野、(59.2±9.7)個/視野,與對照組比較,綠原酸組穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01,圖1)。

A:A498細(xì)胞侵襲能力比較;B:769-P細(xì)胞侵襲能力比較。圖1 A498和769-P細(xì)胞侵襲能力比較(Transwell小室,×400)

2.3 綠原酸對A498、769-P細(xì)胞遷移能力的影響在人腎癌A498細(xì)胞中,對照組和綠原酸組細(xì)胞24 h遷移率分別為(67.8±12.4)%、(23.2±4.3)%;在人腎癌769-P細(xì)胞中,對照組和綠原酸組細(xì)胞24 h遷移率分別為(54.2±10.0)%、(38.6±6.3)%。在人腎癌A498或769-P細(xì)胞中,綠原酸組細(xì)胞遷移率均低于對照組(P<0.05,圖2)。

A:A498細(xì)胞遷移情況比較;B:769-P細(xì)胞遷移情況比較。圖2 A498、769-P細(xì)胞遷移情況比較(劃痕實驗)

2.4 細(xì)胞上清液中IL-1β水平的比較在人腎癌A498細(xì)胞中,對照組和綠原酸組細(xì)胞上清液中IL-1β水平分別為(1.76±0.56)pg/mL、(0.87±0.41)pg/mL;在人腎癌769-P細(xì)胞中,對照組和綠原酸組細(xì)胞上清液中IL-1β水平分別為(1.89±0.72)pg/mL、(0.92±0.43)pg/mL。在人腎癌A498或769-P細(xì)胞中,綠原酸組細(xì)胞上清液中IL-1β水平低于對照組(P<0.05)。

2.5 A498和769-P細(xì)胞中EPAS-1 mRNA表達(dá)水平在人腎癌A498或769-P細(xì)胞中,綠原酸組EPAS-1mRNA表達(dá)水平低于對照組(P<0.05);加入anti-IL-1β后,與對照組比較,對照+anti-IL-1β組EPAS-1 mRNA表達(dá)下降(P<0.05,表2)。

表2 人腎癌A498和769-P細(xì)胞中EPAS-1mRNA表達(dá)水平

2.6 細(xì)胞AKT/P65信號通路蛋白的表達(dá)情況在人腎癌A498或769-P細(xì)胞中,4組細(xì)胞AKT、P65蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較,綠原酸組p-AKT、p-P65蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。加入anti-IL-1β后,與對照組比較,對照+anti-IL-1β組p-P65表達(dá)下降(P<0.05,圖3、表3)。

1.綠原酸組;2.對照組;3.綠原酸+anti-IL-1β組;4.對照+anti-IL-1β組。圖3 A498和769-P細(xì)胞AKT/P65相關(guān)蛋白表達(dá)水平

表3 人腎癌A498和769-P細(xì)胞中p-AKT、p-P65蛋白相對表達(dá)水平

3 討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多種信號傳導(dǎo)通路的失調(diào),是多因素共同作用的結(jié)果。挖掘新靶點和新信號通路已成為腎癌新藥研發(fā)領(lǐng)域的熱點。高頻VHL基因失調(diào)是腎細(xì)胞癌典型特征,尤其是亞型腎透明細(xì)胞癌高達(dá)90%以上。VHL基因的失調(diào),造成大量EPAS-1聚集,引起血管內(nèi)皮生長因子的過表達(dá),促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[9]。已有大量研究證明降低EPAS-1表達(dá)可明顯抑制惡性細(xì)胞的侵襲和遷移,從而抑制腎癌發(fā)展[10-11]。因此,尋找靶向EPAS-1抑制劑被看作腎癌治療的新方向。

劃痕實驗和Transwell結(jié)果顯示綠原酸能夠抑制A498、769-P細(xì)胞的侵襲和遷移;MTT結(jié)果顯示,綠原酸能抑制A498、769-P腎癌細(xì)胞的增殖,且呈時間依賴性,提示綠原酸可能具有治療腎細(xì)胞癌的作用。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn):在人腎癌A498或769-P細(xì)胞中,與對照組比較,綠原酸組EPAS-1 mRNA的表達(dá)水平降低(P<0.05)。這提示綠原酸可抑制腎癌細(xì)胞EPAS-1表達(dá),從而抑制腎癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,減少腎癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此,綠原酸可能成為一種新的EPAS-1抑制劑。

炎性細(xì)胞因子在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面扮演著重要角色,在腎透明細(xì)胞癌、肝癌及胰腺癌等眾多惡性腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá)。有研究報道白介素8(IL-8)可促進(jìn)膀胱癌轉(zhuǎn)移[12],白介素6(IL-6)與食管癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[13],IL-1β與腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]。研究報道,在SW1353細(xì)胞和人原代軟骨細(xì)胞中,IL-1β可通過EPAS-1的表達(dá)來調(diào)節(jié)分解代謝因子的表達(dá)[15]。本研究發(fā)現(xiàn),用抗-IL-1β抗體處理腎癌A498或769-P細(xì)胞可明顯抑制EPAS-1表達(dá),與過往報道一致。ELISA檢測發(fā)現(xiàn):綠原酸與A498或769-P細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后,細(xì)胞上清液中IL-1β水平降低(P<0.05)。推測綠原酸可能是通過抑制IL-1β分泌,抑制了EPAS-1表達(dá),進(jìn)而抑制腎癌細(xì)胞的增殖,減少腎癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

目前炎性因子抑制腎癌細(xì)胞中EPAS-1的機制尚不清楚,但有文獻(xiàn)報道EPAS-1的表達(dá)受AKT/P65信號通路的調(diào)控[16]。另一研究證實[17],AKT/P65信號級聯(lián)可由IL-1β激活,即IL-1β可激活A(yù)KT磷酸化,促進(jìn)P65磷酸化,釋放P65轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,調(diào)控多種基因表達(dá)。本研究中,用抗-IL-1β抗體處理腎癌細(xì)胞后,可明顯抑制p-AKT、p-P65蛋白表達(dá)水平,與文獻(xiàn)報道一致,說明抑制炎性因子IL-1β可抑制AKT/P65信號通路;Western blot檢測發(fā)現(xiàn),在人腎癌A498或769-P細(xì)胞中,與對照組比較,綠原酸組p-AKT、p-P65蛋白表達(dá)水平降低,推測綠原酸可能通過抑制IL-1β的分泌,抑制AKT/P65通路。

綜上所述,綠原酸能夠抑制腎癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,該作用可能與抑制IL-1β分泌,從而抑制AKT/P65信號通路,進(jìn)而調(diào)控EPAS-1的表達(dá)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)綠原酸對腎癌細(xì)胞的影響,特別對EPAS-1有抑制作用,為綠原酸進(jìn)一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。但本研究并未深入探討藥物對腎癌細(xì)胞增殖凋亡存在的影響,以及體內(nèi)實驗的情況,因此綠原酸是否能有效治療腎細(xì)胞癌值得進(jìn)一步研究。下一步我們將進(jìn)行綠原酸對腎癌細(xì)胞增殖凋亡的研究,并考察其相關(guān)作用機制。