張偉　陳雪龍　陳水云　齊艷萍

摘 要：背景：腸道菌群在動(dòng)物的新陳代謝、生長發(fā)育和維持健康過程中發(fā)揮了重要作用，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，使之處于平衡狀態(tài)，從而避免或減少免疫相關(guān)疾病的發(fā)生。一旦腸道菌群紊亂將會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥，此時(shí)可以通過糞菌移植來調(diào)節(jié)小鼠的腸道菌群紊亂并且抑制由于腸道菌群紊產(chǎn)生的內(nèi)毒素血癥等相關(guān)炎癥。方法：將30只健康小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。在相同情況下置于普通動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)一周后，空白組10只小鼠飼喂普通日糧，對(duì)照組10只小鼠添加抗生素，實(shí)驗(yàn)組10只小鼠在飼喂抗生素后進(jìn)行糞菌移植；上述小鼠血清采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10以及LPS；對(duì)其中部分小鼠腸道進(jìn)行基于16S rDNA基因的微生物多樣性檢測(cè)。結(jié)果：對(duì)照組小鼠體內(nèi)的炎性因子LPS、TNF-α、IL-6較空白組組顯著升高（P＜0.05），而IL-10、IL-1β的數(shù)值顯著低于空白組（p＜0.05）；進(jìn)行糞菌移植后，實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)的促炎因子濃度明顯下降，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中LPS、TNF-α、IL-6的水平顯著低于治療前（p＜0.05）；IL-10、IL-1β的水平高于治療前（p＜0.05）；16S rRNA檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)小鼠進(jìn)行糞菌移植后，通過Alpha多樣性和Beta多樣性分析，糞菌移植后的小鼠腸道內(nèi)物種多樣性增加。意義：抗生素能夠?qū)е抡Ｐ∈蟮哪c道菌群紊亂，通過糞菌移植可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而改善內(nèi)毒素血癥。

關(guān)鍵詞：糞菌移植；內(nèi)毒素血癥；腸道菌群紊亂；炎性因子

中圖分類號(hào)：S854.5+3? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2023）03-0049-05

腸道菌群在動(dòng)物的新陳代謝、生長發(fā)育和維持健康過程中發(fā)揮了重要作用，能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，使之處于平衡狀態(tài)，從而避免或減少免疫相關(guān)疾病的發(fā)生，一旦腸道菌群紊亂將會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥。研究發(fā)現(xiàn)抗生素混合物干預(yù)腸道菌群的小鼠，由于腸道菌群缺失會(huì)導(dǎo)致淋巴組織發(fā)育受損、免疫細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡失調(diào)，并改變胃腸道對(duì)感染性或炎性疾病的易感性[1-3]。內(nèi)毒素是一種巨分子化合物類脂多糖體，存在于革蘭氏陰性菌的胞壁外膜之最外層[4]。內(nèi)毒素血癥可以在多系統(tǒng)的多種疾病中出現(xiàn)，通常會(huì)造成致死性感染性休克、多器官功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血等，病死率極高[5，6]。

而糞菌移植是一種將外源健康微生物群落移植到受體腸道中，從而改變患病受體的腸道微生態(tài)紊亂，使之恢復(fù)健康穩(wěn)態(tài)的一種技術(shù)手段。近年來，以FMT為代表的菌群移植技術(shù)在人類的臨床醫(yī)學(xué)上得到了廣泛應(yīng)用，它可以有效治療艱難梭菌等引起的腸炎等疾病[7]。一些在豬上開展的研究表明，使用FMT方法引入外源“健康”或者“功能”菌群能夠快速、有效地改善受體動(dòng)物的腸道健康，優(yōu)化腸道菌群，增強(qiáng)免疫機(jī)能，強(qiáng)化代謝功能[8]。然而，由于糞便菌群與腸道中的菌群在數(shù)量和組成上還有很大不同[9]，因此有必要深入分析和確認(rèn)是否腸道菌移植和糞菌移植會(huì)對(duì)動(dòng)物的生理穩(wěn)態(tài)和代謝進(jìn)程產(chǎn)生差異影響。這將為進(jìn)一步優(yōu)化菌群移植方法的可行性，開發(fā)更為合適的調(diào)控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，同時(shí)也為菌群移植在畜牧業(yè)生產(chǎn)中能夠標(biāo)準(zhǔn)量化提供一定的思路。目前，糞菌移植技術(shù)已經(jīng)在人類醫(yī)療中得以應(yīng)用，即將健康人糞便中的功能性菌群移植至患者胃腸道中，從而通過重建新的腸道菌群來治療腸內(nèi)、外疾病。在畜牧業(yè)中，也可通過該技術(shù)進(jìn)行腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，從而改善內(nèi)毒素血癥。本文旨在通過糞菌移植來調(diào)節(jié)小鼠的腸道菌群紊亂，抑制由于腸道菌群紊導(dǎo)致的內(nèi)毒素血癥等相關(guān)炎癥，為該技術(shù)在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 小鼠分組

健康雄性小鼠，20-25g，于普通動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，自由飲用自來水，室內(nèi)溫度22-26℃，相對(duì)濕度60-80%，定時(shí)通風(fēng)換氣。

將30只小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只小鼠。在相同情況下置于普通動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)一周后，空白組10只小鼠飼喂普通日糧，對(duì)照組10只小鼠添加抗生素，實(shí)驗(yàn)組10只小鼠在飼喂抗生素后進(jìn)行糞菌移植。抗生素處理組采用聯(lián)合抗生素氨芐青霉素8g/L、硫酸新霉素（8g/L和萬古霉素4g/L），建立內(nèi)毒素血癥模型。

1.2 體征評(píng)分

在飼喂抗生素后，觀察一周，對(duì)小鼠的臨床癥狀，如小鼠出現(xiàn)呆滯，豎毛，呼吸困難，腹瀉等行為進(jìn)行評(píng)分；腹瀉評(píng)分參考文獻(xiàn)，以大便性狀為計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)小鼠每日血便情況和大便性狀進(jìn)行評(píng)分，大便性狀正常計(jì)0分，軟但成形計(jì)１分，未成形便計(jì)２分，稀便計(jì)３分。血便情況潛血陰性計(jì)０分，隱血陽性計(jì)１分，便中帶血計(jì)２分，血便計(jì)３分。兩項(xiàng)評(píng)分相加得分，以上行為各記一分，大于一分則認(rèn)為存在炎癥。通過觀察發(fā)現(xiàn)飼喂抗生素的小鼠出現(xiàn)呆滯，腹瀉行為。

小鼠糞便軟且成型計(jì)1分，便中帶血計(jì)2分，大于標(biāo)準(zhǔn)一分，所以則認(rèn)為小鼠體內(nèi)存在炎癥。

1.3 內(nèi)毒素血癥檢測(cè)

采集小鼠血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL10等抗炎細(xì)胞因子和LPS濃度，通過對(duì)比飼喂抗生素前后試劑盒檢測(cè)的血清濃度評(píng)價(jià)是否患內(nèi)毒素血癥，再通過灌胃后觀察血清濃度是否發(fā)生變化來觀察是否對(duì)腸道菌群紊亂的小鼠有治療效果。

1.4 糞菌移植

將正常小鼠的糞便稀釋離心后制備健康菌群混懸液。腸道菌群紊亂的小鼠灌胃給予混懸液500μL，每日2次，連續(xù)灌胃五日。利用16S和ELISA檢測(cè)腸道菌群、TNF-α、IL-1β、IL-6等血清指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對(duì)小鼠血清炎性細(xì)胞因子的影響

由表1可知，給予抗生素后，對(duì)照組小鼠體內(nèi)炎性指標(biāo)TNF-α、IL-6的數(shù)值顯著高于空白組小鼠（p＜0.05），IL-10、IL-1β的數(shù)值低于空白組（p＜0.05），LPS的數(shù)值顯著高于空白組（p＜0.05）。

2.2 糞菌移植對(duì)血清炎性細(xì)胞因子的影響

對(duì)患內(nèi)毒素血癥小鼠進(jìn)行糞菌移植后，用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。由表1可知，在進(jìn)行糞菌移植后，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TNF-α、IL-6的水平顯著低于治療前（p＜0.05）；IL-10、IL-1β的水平高于治療前（p＜0.05），LPS的水平明顯低于治療前（p＜0.05）。

2.3 測(cè)序結(jié)果分析

在對(duì)10只加入抗生素的小鼠7只正常飼喂的小鼠以及4只灌胃后的小鼠采取其糞便標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序后，我們對(duì)3組的小鼠糞便樣本進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序分析。根據(jù)測(cè)序及注釋結(jié)果，所有糞便樣本中共檢測(cè)出15054個(gè)OTU。維恩圖（圖2）展示出三組小鼠糞便中OTU組成情況。其中三組共有的OTU為核心OTU共22個(gè)。對(duì)照組，空白組，實(shí)驗(yàn)組所特有的OTU數(shù)分別為7162、1085、5347個(gè)。

我們使用Past數(shù)據(jù)分析軟件繪制香農(nóng)曲線（shannon rarefaction curve）來評(píng)估測(cè)序數(shù)量是否足夠，shannon稀釋曲線還能間接代表著標(biāo)本中微生物菌群的豐富程度。香農(nóng)指數(shù)作為一個(gè)評(píng)價(jià)樣品內(nèi)物種多樣性程度的指標(biāo)，其數(shù)值越大表示樣品中的多樣性程度越高。從圖3中可看出，隨著數(shù)量的增多，每個(gè)糞便標(biāo)本中的香農(nóng)指數(shù)期望值曲線都達(dá)到平臺(tái)區(qū)，代表本次測(cè)序的結(jié)果可以覆蓋住糞便樣本中大部分細(xì)菌的物種豐度，說明此次測(cè)序的結(jié)果是合理的，測(cè)序結(jié)果能代表糞便樣本中微生物群的多樣化特點(diǎn)。為了探討糞菌移植后腸道菌群多樣性和豐度變化，比較菌群多樣性指數(shù)圖3列出了Alpha多樣性分析參數(shù)，包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。根據(jù)Alpha多樣性分析顯示，在加入抗生素以后小鼠體內(nèi)的菌群多樣性顯著低于空白組（P＜0.05）。在對(duì)腸道菌群紊亂的小鼠進(jìn)行糞菌移植后，糞菌移植組腸道菌群多樣性明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。由圖可見，表明幼年小鼠經(jīng)抗生素混合物干預(yù)腸道菌群后，對(duì)飼喂抗生素的小鼠進(jìn)行糞菌移植后可以看出相對(duì)于空白組小鼠Alpha多樣性增加，腸道內(nèi)物種多樣性增加，小鼠體內(nèi)的腸道菌群更加豐富。

為了探討FMT后腸道菌群群落之間的相似度，采用基于binary-euclidean算法的PCoA（Principal co-ordinates analysis）分析方法進(jìn)行β多樣性分析。兩點(diǎn)之間的距離越近，表明兩個(gè)樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度越高，差異越小。Beta多樣性如PCA圖（圖4）中所示，橫坐標(biāo)PC1貢獻(xiàn)度為40.6%，縱坐標(biāo)PC2貢獻(xiàn)度為14.1%，三組小鼠腸道菌群可明顯區(qū)分，同一組內(nèi)小鼠樣本聚集在一起，說明同組內(nèi)小鼠腸道菌群相似度高；組間小鼠樣本在空間距離較遠(yuǎn)，表明組間樣本相似度低。結(jié)果顯示，對(duì)照組與空白組和糞菌移植組樣本相似度低，糞菌移植組與空白組之間腸道菌群相似度高。

3 討論與分析

相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎患者常伴有腸道菌群失衡。有益菌群數(shù)量減少，有害菌群增多，導(dǎo)致腸道屏障功能受損，促進(jìn)疾病進(jìn)展[10]。同時(shí)，腸道存在促炎與抗炎因子的動(dòng)態(tài)平衡，結(jié)腸炎發(fā)生與促炎、抗炎因子動(dòng)態(tài)平衡失衡存在密切聯(lián)系，其中TNF-α、IL-6等具有重要促進(jìn)作用[11]。局部炎癥反應(yīng)會(huì)促進(jìn)IL-6等分泌與合成，而IL-6等又會(huì)誘導(dǎo)大量TNF-α產(chǎn)生，進(jìn)而加重結(jié)腸炎患者病情[12]。因此調(diào)解腸道菌群、減輕患者炎癥反應(yīng)是結(jié)腸炎治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在生命剛開始就存在于腸道里的菌群，對(duì)于構(gòu)建腸道菌群及對(duì)腸道能否保持健康起著重要作用，生命早期使用抗生素能夠破壞這些菌群的優(yōu)勢(shì)作用并延遲腸道菌群的正常構(gòu)建[13]?？股貙?duì)腸道菌群的影響是持久的，根據(jù)抗菌藥物的作用范圍、劑量、給藥途徑和治療時(shí)間，抗菌藥物可以極大地改變腸道和口腔內(nèi)微生物群落的組成[14]。在攝入抗生素后的幾天內(nèi)，微生物的多樣性通常會(huì)減少，而且很少能完全恢復(fù)最初的細(xì)菌群落組成。有研究報(bào)道一歲以內(nèi)嬰兒使用抗生素后腸道內(nèi)雙歧桿菌和擬桿菌相對(duì)豐度減少和細(xì)菌群落的多樣性減少，這會(huì)使新生兒存在使用抗生素后潛在的抗生素耐藥或腸道菌群紊亂相關(guān)疾病的危險(xiǎn)中[15]。腸道菌群在動(dòng)物的新陳代謝、生長發(fā)育和維持健康過程中發(fā)揮了重要作用，腸道菌群紊亂會(huì)促使條件致病菌（有害菌）過度生長和繁殖，引起胃腸道內(nèi)毒素（LPS）含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致腸粘膜屏障受到破壞、通透性增加造成腸源性LPS入血[16]，LPS隨血液流經(jīng)全身各器官組織，使機(jī)體發(fā)生系統(tǒng)性慢性炎癥，從而引起亞臨床內(nèi)毒素血癥。這與本實(shí)驗(yàn)中對(duì)正常小鼠飼喂抗生素后，體內(nèi)炎性因子發(fā)生的變化一致，在給予抗生素后，小鼠血清濃度含有的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10與空白組相比均有明顯變化，其中TNF-α、IL-6的水平比空白組水平顯著增高，LPS的數(shù)值顯著高于空白組，而IL-10和IL-1β的水平則比空白組顯著降低。這與吳思謀的長期抗生素暴露對(duì)高脂飲食負(fù)荷小鼠糖代謝和腸道菌群的影響研究中的觀點(diǎn)一致。長期飼喂抗生素可以干預(yù)高脂飲食負(fù)荷小鼠的腸道菌群，并且調(diào)節(jié)代謝紊亂的研究結(jié)果一致[17]。

糞菌移植又稱為糞便細(xì)菌治療或腸道菌群移植，是指將健康供體的糞便微生物通過上消化道或下消化道途徑轉(zhuǎn)移至患病個(gè)體的胃腸道，通過重建腸道菌群、調(diào)節(jié)菌群與宿主間的相互作用，達(dá)到治療疾病的目的。糞菌移植是通過口服或灌腸的方法，將健康機(jī)體糞便送入腸道，有助于腸道菌群的恢復(fù)和減少細(xì)菌耐藥。研究表明，糞菌移植對(duì)于調(diào)節(jié)結(jié)腸炎患者腸道菌群平衡、重建腸道微生態(tài)系統(tǒng)及恢復(fù)腸黏膜屏障有明顯療效，在治療艱難梭菌相關(guān)腹瀉、炎癥性腸病和免疫治療相關(guān)結(jié)腸炎的成功經(jīng)驗(yàn)也說明其在改變腸道菌群的組成以促進(jìn)個(gè)體健康中的作用[18]。在2003年一項(xiàng)研究報(bào)告指出，6例反復(fù)發(fā)作的重癥UC患者在接受FMT治療后，臨床癥狀得到緩解，并且電子結(jié)腸鏡檢查和組織血檢查后發(fā)現(xiàn)，患者的腸道炎性癥狀緩解及組織黏膜得到修復(fù)[19]。由此可見，腸道菌群平衡對(duì)維持小鼠腸黏膜免疫屏障功能方面同樣具有重要作用，若腸道菌群失調(diào)便可激活腸道內(nèi)多種免疫細(xì)胞，釋放大量炎癥介質(zhì)因子，因此，糞菌移植能夠調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)健康小鼠飼喂抗生素導(dǎo)致腸道菌群紊亂，從而導(dǎo)致小鼠體內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥，小鼠出現(xiàn)眼珠發(fā)紅，糞便多成稀狀，精神狀態(tài)萎靡等臨床癥狀，而通過糞菌移植治療腸道菌群紊亂后，小鼠臨床癥狀有所減輕，精神狀態(tài)活躍，糞便逐漸正常。在對(duì)患內(nèi)毒素血癥小鼠進(jìn)行糞菌移植后，通過小鼠體內(nèi)的炎性因子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行糞菌移植后，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TNF-α、IL-6的水平顯著低于治療前（p＜0.05）；IL-10、IL-1β的水平高于治療前（p＜0.05），LPS的水平明顯低于治療前（p＜0.05）。小鼠的內(nèi)毒素血癥狀況得到改善，臨床癥狀和血清指標(biāo)充分說明糞菌移植在對(duì)于腸道菌群紊亂的治療中起到明顯的效果，也充分證實(shí)了糞菌移植是有效的治療方法。

綜上所述，糞菌移植能夠改善抗生素導(dǎo)致的小鼠腸道菌群紊亂，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而改善內(nèi)毒素血癥。

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收稿日期：2022-11-19

基金項(xiàng)目：安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2021A0872）

通訊作者：齊艷萍（1979-），女，黑龍江綏化人，教授，博士，主要從事動(dòng)物流行病學(xué)及疫病防控方面的研究，E-mail：qiyanping2018@vip.163.com