鄭蕾，馬龍，牛曼思，向玲，屠婷瑤，賈俊杰，鄭焱丹，王世寬，沈才洪*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川自貢 643000；2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司/國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000；3.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一[1-2]，與其他蒸餾酒相比，白酒的工藝復(fù)雜，原料來源豐富，品類繁多且風(fēng)格獨特[3]。根據(jù)不同的生產(chǎn)工藝及風(fēng)味特征，白酒分為十二種香型，其中醬香型白酒是四大基本香型之一[4]。醬香型白酒經(jīng)九次蒸煮、八次發(fā)酵、七次取酒、高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒等特殊工藝釀制而成[5]，其釀制周期長，具有“醬香突出、幽雅細(xì)膩、回味悠長、空杯留香持久”的感官特點[6]，因此醬香型白酒廣受消費者歡迎。自然環(huán)境是白酒釀造的重要影響因素之一[7]，白酒的風(fēng)味特征也在一定程度上受地理位置的影響[8]。

醬香型白酒被認(rèn)為是十二大香型白酒中風(fēng)味物質(zhì)組成最為復(fù)雜的[8]，其主體香仍不清楚[9]。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在醬香型白酒香氣中起著重要作用，并與醬香型白酒的質(zhì)量高度相關(guān)[10]。白酒風(fēng)味化合物的分析方法主要涉及風(fēng)味化合物的提取、分離以及成分的檢測[11]，常用的提取方法有直接進(jìn)樣法、固相微萃?。⊿PME）法和液液萃?。↙LE）法等；氣相色譜配備氫火焰離子化檢測器（GC-FID）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等儀器已廣泛應(yīng)用于白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分離和檢測[12]。直接進(jìn)樣法多用于測定分析白酒中含量較高的骨架物質(zhì)成分；SPME 多適用于異嗅化合物[13-14]、萜烯類化合物[15]、吡嗪類化合物[16]、含硫化合物[17]等物質(zhì)的提取檢測；LLE 在一些極性較強(qiáng)的化合物或在某些風(fēng)味物質(zhì)定量處理中應(yīng)用較多[18-21]。陳華明等[22]采用GCFID 和GC-MS 從成品醬香型白酒中分別定量出45種化合物（醇醛酯類）和21種含氮化合物為主的風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的香氣活力值（OAV）確定了成品醬香白酒中的29種主要風(fēng)味組分。

隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，研究者進(jìn)一步闡明了白酒風(fēng)味感官差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，目前已有研究表明，利用GC-IMS、GC-FID、HS-SPME-GC-MS 和感官品評手段對四川、貴州、黑龍江以及河北的醬香型白酒進(jìn)行檢測分析，4 個產(chǎn)地的醬香型白酒在感官風(fēng)味特征及揮發(fā)性化合物上均存在較大的差異[23-24]。由于企業(yè)間的工藝技術(shù)、勾兌技術(shù)相互學(xué)習(xí)，部分企業(yè)的醬香型白酒風(fēng)味特征與該產(chǎn)地醬酒主要風(fēng)味特征也會存在較明顯差異[25]。因此本研究在醬香型白酒風(fēng)味研究基礎(chǔ)上，利用QDA、直接進(jìn)樣的香味提取技術(shù)結(jié)合GC-FID 進(jìn)行感官評定和高含量的重要揮發(fā)性成分分析，采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對貴州省遵義市仁懷市（RH）、貴州畢節(jié)市金沙縣（JS）、四川省瀘州市古藺縣（GL）以及黑龍江省齊齊哈爾市（QS）4 個產(chǎn)地的醬香型白酒進(jìn)行研究，探究重要的差異性揮發(fā)性化合物，為醬香型白酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

白酒樣品：RH-1、RH-2、RH-3和RH-4（53%vol，購自貴州省遵義市仁懷市某公司），JS-1、JS-2 和JS-3（53 %vol，購自貴州省畢節(jié)市金沙縣某公司），GL-1、GL-2、GL-3 和GL-4（53 %vol，購自四川省瀘州市古藺縣某公司），QS-1、QS-2和QS-3（53%vol，購自黑龍江省齊齊哈爾市某公司）。

試劑：色譜級標(biāo)準(zhǔn)品：乙醛、異丁醛、丙酮、甲縮醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙縮醛、甲醇、2-甲基丁醛、異戊醛、乙醇、丙酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸丙酯、二乙酰、丁酸乙酯、2-丁醇、丙醇、異丁醇、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、丁醇、戊酸乙酯、2-甲基丁醇、異戊醇、己酸乙酯、戊醇、乙基糠基醚、乙偶姻、乳酸乙酯、己醇、糠醛、辛酸乙酯、苯甲醛、2,3-丁二醇（左旋）、2,3-丁二醇（內(nèi)消旋）、1,2-丙二醇、糠醇、苯乙酸乙酯、苯乙醇、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯（純度均≥99 %），上海安譜實驗科技股份有限公司。

內(nèi)標(biāo)物質(zhì)：叔戊醇和乙酸正戊酯（純度均≥99.5%），天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

儀器設(shè)備：氣相色譜儀（GC-2010 Plus），島津企業(yè)管理（中國）有限公司；DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μ m），美國Agilent 公司；渦旋儀（S0200-230V-EV），美國Labnet 公司；萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；集中供水裝置（PC-2RP-EDI），成都品成科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 感官評價方法

根據(jù)GB/T 10220—2012《感官分析方法學(xué) 總論》，品評小組構(gòu)建：品評小組共6 人，20～35 歲，品評組成員均為具有3 年以上白酒品評經(jīng)驗（國家級/省級白酒評委）的嘗評員。感官品評環(huán)境設(shè)定：設(shè)置在安靜、通風(fēng)、無味的白酒品評室，室內(nèi)溫度為20～25 ℃，濕度為60%左右，室內(nèi)光線充足、柔和，墻壁沒有強(qiáng)烈的反射。感官品評方式：暗碼編組盲評法。

感官品評前先培訓(xùn)品評人員，熟悉感官描述詞，按表1 列明的感官屬性及相關(guān)感官描述詞評定各感官屬性的強(qiáng)度，評定分?jǐn)?shù)為0～5 分，0 分表示未聞到，5 分為聞到的香氣最強(qiáng)。通過計算評分確定其結(jié)果。

表1 醬酒競品感官屬性及描述語

表2 42種重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)和精密度試驗

表3 不同產(chǎn)地醬香型白酒中揮發(fā)性化合物GC-FID定量結(jié)果 (mg/L)

1.2.2 GC-FID 分析參數(shù)

檢測條件：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣體積為1 μ L，采用恒流的分離模式，分流比選擇40∶1，載氣為高純氮氣（≥99.95 %），柱前壓力117.6 kPa，柱流量0.8 mL/min，線速度25.6 cm/s，吹掃流量3.0 mL/min，總流量35.8 mL/min，氫氣和空氣流量分別為40 mL/min 和400 mL/min，F(xiàn)ID 檢測器溫度為250 ℃。

程序升溫條件：35 ℃保持3 min，3 ℃/min 升溫至80 ℃，保持1 min，5 ℃/min 升溫至100 ℃，保持3 min，6 ℃/min 升溫至160 ℃，隨后以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持17 min。

1.2.3 定性與定量分析

根據(jù)目前報道及前期實驗，本研究對醬香型白酒中含量較高的重要揮發(fā)性香氣成分采用GC-FID與配制的風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品保留時間進(jìn)行定性分析。采用內(nèi)標(biāo)法定量，配制五個濃度梯度的風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液各組分質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值（x）為橫坐標(biāo)，各組分峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，繪制內(nèi)標(biāo)定量法校準(zhǔn)曲線。為驗證方法的精密度，參照GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》方法，設(shè)計精密度實驗。精密度實驗用配制標(biāo)準(zhǔn)曲線第二濃度點的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同色譜條件下重復(fù)測定6 次，計算各組分的精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%）[26]，結(jié)果如表2 所示。

1.2.4 香氣活力值（Odor Activity Value,OAV）的計算

閾值是風(fēng)味化學(xué)中連接化學(xué)含量與感官特性的橋梁，識別閾值是風(fēng)味化學(xué)中研究關(guān)鍵香氣成分重要性的參考指標(biāo)。根據(jù)GB/T 33406—2016《白酒風(fēng)味閾值測定指南》中的十杯法（Ten Sample Test,TST法）及ASTM 標(biāo)準(zhǔn)E1432 中的最佳估計閾值法（Best Estimate Threshold,BET法）測定揮發(fā)性成分的香氣閾值（Odor Threshold,OT），按照公式（2）計算OAV[22]。

式中：c 表示揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度，mg/L；A 表示揮發(fā)性成分氣味OT，μ g/L。

OAV≥1，則表示氣味的貢獻(xiàn)值較大[27]，OAV＜1，則代表該風(fēng)味物質(zhì)在樣品中對風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地醬香型白酒感官評定結(jié)果分析

利用感官定量描述分析結(jié)果繪制感官雷達(dá)圖（圖1），單因素方差分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地白酒在陳香、曲香、醬香、醛香、果酸香、烘焙香、糧香、酯香、果酸味、甜味、咸味、鮮味、柔和度、細(xì)膩度、豐滿度和舒適度感官屬性存在顯著性差異（p＜0.05）。在香氣上，GL 產(chǎn)地醬酒樣品以陳香、青草香、花果香為主，有明顯醬香，曲香相對較弱，整體香氣偏清雅；QS 產(chǎn)地醬酒樣品呈現(xiàn)以糧香、酯香、糟香為主，醬曲香相對不明顯，整體香氣強(qiáng)度較弱；貴州省的醬酒樣品以醬香、糟酸香、烘焙香為主，有明顯堅果香和窖底香，整體香氣濃郁，其中RH 產(chǎn)地樣品以陳香、曲香、醬香、果酸香為主，有明顯烘焙香和堅果香，整體香氣強(qiáng)度較GL 產(chǎn)地更強(qiáng)；JS 產(chǎn)地醬酒樣品以醬香、糧香、醛香為主，有明顯糟香和辛香料香氣，醬香和醛香較突出。

在口味上，不同產(chǎn)地的樣品均以酸味和甜味為主，帶有澀味，略有咸味和苦味，RH 產(chǎn)地樣品的果酸味和鮮味較突出；QS 產(chǎn)地醬酒樣品相較于其他產(chǎn)地酸味和甜味強(qiáng)度更弱，苦味較強(qiáng)；JS 產(chǎn)地樣品以酸味為主，甜味較明顯，略有咸味；GL 產(chǎn)地樣品以甜味為主，酸味較明顯，略有苦味，可能是四川緯度較高，氣候相對更加溫和，加之四川大環(huán)境以濃香型白酒為主，川醬自然也帶有一些濃香型白酒的“甜感”[28]。在口感上不同產(chǎn)地的醬酒各有特色，GL 產(chǎn)地樣品口感的柔和度和舒適度較高，RH 產(chǎn)地樣品口感的細(xì)膩度、柔和度、豐滿度以及整體的舒適度都較好，JS 產(chǎn)地樣品口感的細(xì)膩度和舒適度較高，QS 醬酒樣品表現(xiàn)為酒體舒適度較高，而細(xì)膩度、豐滿度、柔和度較低，這三項指標(biāo)與酸味、甜味、苦味三者的平衡感有較大的關(guān)系。

2.2 不同產(chǎn)地醬香型白酒GC-FID 數(shù)據(jù)分析

按照上述定性定量方法，采用直接進(jìn)樣的方法，通過GC-FID 對14 個醬香型白酒樣品的42種較高含量風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了數(shù)據(jù)采集，各樣品對應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)含量如表3 所示。

對不同產(chǎn)地的14 個樣品中各類（除醇醛酯類外，剩余的記為其他類）風(fēng)味物質(zhì)含量及其占比做了柱狀圖分析（圖2）。從圖2A 可以看出，不同產(chǎn)地樣品風(fēng)味物質(zhì)的總含量存在一定的界限。QS 產(chǎn)地樣品的風(fēng)味物質(zhì)含量遠(yuǎn)低于其他3 個產(chǎn)地，JS 產(chǎn)地的樣品風(fēng)味物質(zhì)含量最高，造成這兩個產(chǎn)地差異的原因主要在于兩個產(chǎn)地的醇類總含量差異；RH 產(chǎn)地、QS 產(chǎn)地和GL 產(chǎn)地的酯類含量在4000 mg/L 左右；GL 產(chǎn)地的醛類物質(zhì)含量高于其他3 個產(chǎn)地。從圖2B 中可以看出，產(chǎn)自貴州省的醬香型白酒（RH 產(chǎn)地和JS 產(chǎn)地）的其他類物質(zhì)占比高于GL 產(chǎn)地和QS 產(chǎn)地。

圖2 不同產(chǎn)地醬香型白酒樣的風(fēng)味物質(zhì)種類總含量分布（A）和百分比分布（B）

聚類分析可以更好的了解不同樣品的分類問題以及觀察樣品不同風(fēng)味物質(zhì)的差異[29]。為了比較不同產(chǎn)地醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)之間的差異，對不同產(chǎn)地14 個醬香型白酒樣品的風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)采用標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)的方式處理后進(jìn)行差異比較與聚類，結(jié)果如圖3 所示。從整體上來看，JS 產(chǎn)地的風(fēng)味物質(zhì)對應(yīng)的顏色最深，QS 產(chǎn)地的顏色最淺，對應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)總含量最高和最低，與圖2A 結(jié)果相對應(yīng)。RH 和JS 產(chǎn)地酒樣的一些高沸點風(fēng)味物質(zhì)，如苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯和亞油酸乙酯等要高于GL 和QS 產(chǎn)地。RH 產(chǎn)地樣品中的乙偶姻、2,3-丁二醇（左旋）和乙基糠基醚顯著高于其他3 個產(chǎn)地；JS 樣品風(fēng)味物質(zhì)的含量雖然整體水平最高，但是其乙酸乙酯卻是所有產(chǎn)地中最低的；丁酸乙酯和戊酸乙酯在QS 產(chǎn)地的含量普遍高于其他3 個產(chǎn)地；GL樣品中的辛酸乙酯、己酸乙酯、甲縮醛、乙縮醛、甲酸乙酯和乙醛等這些出峰早的小分子風(fēng)味物質(zhì)遠(yuǎn)高于其他3 個產(chǎn)地。

圖3 氣相檢測不同樣品風(fēng)味物質(zhì)含量聚類熱圖

圖4 GC-FID 檢測不同樣品的風(fēng)味物質(zhì)含量的PCA 分析（A）和OPLS-DA 分析（B）

圖5 氣相檢測不同樣品風(fēng)味物質(zhì)含量的VIP圖

圖6 GC-FID 定量的風(fēng)味物質(zhì)OAV 熱圖

主成分分析和正交偏最小二乘判別分析可以可視化的對比不同組別間的差異。主成分分析是一種無監(jiān)督進(jìn)行數(shù)據(jù)降維的方法，將多個原始參數(shù)化為少數(shù)幾個新指標(biāo)，并能最大限度保留樣本原始信息[30]，有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析可以更準(zhǔn)確的檢測到不同產(chǎn)地間差異及差異風(fēng)味化合物。對不同產(chǎn)地樣品風(fēng)味物質(zhì)成分的GC-FID 數(shù)據(jù)進(jìn)行了PCA 和OPLS-DA 分析，如圖4 所示。從PCA 分析中（圖4A）可以看出PC1+PC2＞50 %，前兩個主成分已經(jīng)可以解釋大多數(shù)數(shù)據(jù)。QS 產(chǎn)地和RH 產(chǎn)地對應(yīng)的樣品較為集中；JS 產(chǎn)地和GL 產(chǎn)地類似，樣品較為分散，其中JS-2 與GL-4 遠(yuǎn)離同產(chǎn)地的其他樣品。通過有監(jiān)督的OPLS-DA 分析可以看出（圖4B），各個產(chǎn)地的樣品都相對集中，和其他產(chǎn)地有明顯的區(qū)分。貴州省兩個產(chǎn)地之間的樣品也較為相似，基本上分布在第四象限；QS 產(chǎn)地的樣品分布在第三象限；GL 的樣品分布在y 軸正半軸。

變量重要性投影（VIP）可以衡量樣品間變量的貢獻(xiàn)大小，VIP 值越大，說明該變量對樣品組間分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力越強(qiáng)，因此可以根據(jù)建立的正交偏最小二乘判別模型變量重要性投影值計算各品質(zhì)性狀重要性。進(jìn)一步根據(jù)OPLS-DA生成的VIP 值篩選不同產(chǎn)地間差異成分，如圖5 所示。對4 個產(chǎn)地醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行組間比較發(fā)現(xiàn)，VIP＞1 的差異化合物共有18種，其中酯類物質(zhì)有9種，醇類物質(zhì)6種，醛類物質(zhì)1種，其他類2種?？梢钥闯龃碱惡王ヮ惢衔锸窃斐刹煌a(chǎn)地樣品間重要差異的風(fēng)味物質(zhì)，也表明醇類和酯類對醬香型白酒具有重要的貢獻(xiàn)[10]。

通過查閱相關(guān)資料和閾值測定實驗，結(jié)果表明甲醇和1,2-丙二醇溶于53 %vol 乙醇溶液中，只能聞到乙醇的味道，缺乏相關(guān)的閾值數(shù)據(jù)[27]。結(jié)合氣相色譜的定量結(jié)果和閾值測定結(jié)果，計算出了14個樣品中剩余的40種風(fēng)味物質(zhì)的OAV 并列入表4中，采用取log10（原始數(shù)據(jù)+0.01）的縮放方式處理后進(jìn)行聚類分析，繪制了相關(guān)熱圖（圖6），顏色越深表明該風(fēng)味物質(zhì)對樣品的風(fēng)味貢獻(xiàn)越大。從圖6可以直觀看出，乙醛、戊酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙縮醛、乙酸乙酯、異丁酸乙酯和棕櫚酸乙酯對所有樣品的風(fēng)味物質(zhì)都具有重要貢獻(xiàn)；乙基糠基醚、糠醇、戊醇、甲酸乙酯、甲縮醛、2-甲基丁醇、糠醛、苯甲醛、2,3-丁二醇（左旋）和2,3-丁二醇（內(nèi)消旋）對整體風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)最低。值得一提的是，除QS 產(chǎn)地的樣品外，2-甲基丁醛對其他三個產(chǎn)地的樣品風(fēng)味都具有較大的貢獻(xiàn)；并且2-甲基丁酸乙酯、異丁醛、苯乙酸乙酯、乙酸丙酯和二乙酰等對QS 產(chǎn)地的貢獻(xiàn)顯著低于其他3 個產(chǎn)地。

表4 不同產(chǎn)地樣品風(fēng)味物質(zhì)的OAV

3 結(jié)論

本試驗對貴州省遵義市仁懷市、貴州省畢節(jié)市金沙縣、四川省瀘州市古藺縣以及黑龍江省齊齊哈爾市四個產(chǎn)地的醬香型白酒進(jìn)行評定和檢測，結(jié)果表明四個產(chǎn)地在醬酒香氣特征中的陳香、曲香、醬香、醛香、果酸香、烘焙香、糧香、酯香和口感特征中的果酸味、甜味、咸味、鮮味、柔和度、細(xì)膩度、豐滿度和舒適度的特征上均存在顯著性差異（p＜0.05），RH 產(chǎn)地醬酒的陳香、曲香、醬香、果酸香較突出，JS 產(chǎn)地醬酒樣品醬香、糧香、醛香較突出，有明顯糟香和辛香料香氣，GL 產(chǎn)地醬酒糧香、青草香、花果甜香和甜味較突出，QS 產(chǎn)地樣品糧香、酯香、糟香較突出，醬曲香相對不明顯，所呈現(xiàn)的感官屬性與GL 產(chǎn)地的相似，但香氣強(qiáng)度相對較弱。利用GC-FID 從樣品中定性和定量出42種含量較高的揮發(fā)性成分，并通過PCA 和OPLS-DA 分析，貴州、四川、黑龍江三省4 個產(chǎn)地的醬香型白酒樣品距離較遠(yuǎn)，在風(fēng)格特征上自成派系且在風(fēng)味物質(zhì)成分上均有一定的差異。通過篩選OAV 值發(fā)現(xiàn)，乙醛、戊酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、異戊醛、丙醇、丁醇、乳酸乙酯、苯乙醇、乙縮醛、乙酸乙酯、異丁酸乙酯和棕櫚酸乙酯這13種風(fēng)味物質(zhì)對所選樣品的風(fēng)味貢獻(xiàn)程度都很高（OAV＞10）。VIP＞1 的差異化合物共有18種，其中酯類物質(zhì)有9種，醇類物質(zhì)6種，醛類物質(zhì)1種，其他類2種。在OAV 和VIP 兩種手段篩選出的重要風(fēng)味物質(zhì)中，醇類和酯類占比最高，驗證了醇類和酯類對醬香型白酒香味具有重大貢獻(xiàn)的說法。本次研究更加細(xì)化了不同產(chǎn)地醬香型白酒的感官特征及風(fēng)味物質(zhì)成分的差異，為醬香型白酒生產(chǎn)過程及產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控提供了科學(xué)依據(jù)。