張靜，熊樂(lè)樂(lè)，章瑛，張春華，熊蔚

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

強(qiáng)力枇杷露具養(yǎng)陰斂肺，鎮(zhèn)咳祛痰的功效，用于久咳勞嗽，支氣管炎等的治療。原標(biāo)準(zhǔn)收載于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二冊(cè)WS3-B-0442-90［1］，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2020年一部［2］。強(qiáng)力枇杷露是由枇杷葉、罌粟殼、百部、白前、桑白皮、桔梗、薄荷腦等七味中藥和蔗糖制成，含適量枸櫞酸、香精和苯甲酸鈉，含蔗糖量為60%（g/mL），為高濃度蔗糖水溶液。

強(qiáng)力枇杷露因服用方便、吸收快速、效果顯著、病人接受程度高等特點(diǎn)而獲得廣泛使用，大多為多劑量包裝［3］。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版四部［4］通則0116 糖漿劑項(xiàng)下規(guī)定，糖漿劑在制劑處方確定之初，該處方的抑菌效力就應(yīng)符合抑菌效力檢查法。強(qiáng)力枇杷露處方中使用的抑菌劑為苯甲酸鈉，處方含量為0.25%。而《中國(guó)藥典》2020 年版與2015 年版在抑菌效力檢查法上最大的不同在于：除了考慮不同種類型的菌落，包括革蘭陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌），革蘭陰性菌（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌），致病酵母菌（白色念珠菌）和霉菌（黑曲霉），還特別提出若需要，制劑中常見的污染微生物也可作為試驗(yàn)菌株，例如高濃度糖的口服溶液還應(yīng)選用魯氏酵母作為試驗(yàn)菌株。魯氏酵母是最常見的耐高滲酵母，能在高濃度的蔗糖溶液中生長(zhǎng)，但目前為止尚未發(fā)現(xiàn)魯氏酵母對(duì)人類存在致病性。

因此，本研究擬參照《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則1121 抑菌效力檢查法對(duì)不同企業(yè)的不同有效期、不同pH 值、不同水活度的強(qiáng)力枇杷露抑菌效力進(jìn)行考察，除常見的五株菌外另選用魯氏酵母進(jìn)行抑菌考察［5］。同時(shí)制備缺罌粟殼的陰性樣品，使用枸櫞酸調(diào)節(jié)pH、蔗糖調(diào)節(jié)水活度，考察樣品在不同pH、不同水活度情況下，對(duì)所添加的抑菌劑苯甲酸鈉抑菌效力的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YXQ-LS-50S Ⅱ型高壓蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)醫(yī)療器械有限公司）；SW-CJ-2D 凈化工作臺(tái)（蘇州凈化有限公司）；Heal Force-900C 生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；PYX-DHS 細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；KB400 霉菌培養(yǎng)箱（BINDER 公司）；HH.W21.600S 電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；FE20K pH 計(jì)和Sartorious T601-L 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Aqualab 4TEV 水分活度測(cè)定儀和PE20K 酸度計(jì)（METTLER TOLEDO）。

1.2 菌種

魯氏酵母（Saccharomyces rouxii）購(gòu)自國(guó)家菌種保藏中心，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）、白色念珠菌（Candida albicans）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 培養(yǎng)基與試劑

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（青島海博生物技術(shù)有限公司），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)有限公司），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），苯甲酸鈉（批號(hào)：100433-201702，含量 99.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院），蔗糖（批號(hào)：20201105，分析純，廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司），薄荷腦（批號(hào)：20210317，含量99.0%，江西華豫源生物科技有限公司），枇杷葉、百部、白前、桑白皮、桔梗等飲片均購(gòu)自市售連鎖藥店。

1.4 樣品

強(qiáng)力枇杷露9 批次，來(lái)源于日常抽檢及市場(chǎng)采購(gòu)。具體樣品信息詳見表1。

表1 強(qiáng)力枇杷露樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 自制樣品和菌懸液的制備

2.1.1 自制樣品的制備 取枇杷葉69 g、百部15 g、白前9 g、桑白皮6 g、桔梗6g 等五味藥材飲片加水煎煮兩次，每次加水2 L，煎煮2 h，合并藥液，濾過(guò)，濾液濃縮至500 mL，加蔗糖600 g，加熱至沸騰并保持20 min，靜置1 h，濾過(guò)，加入用乙醇溶解的0.15 g 薄荷腦，攪拌混勻，靜置，濾過(guò)，并加水至1 000 mL。取上述溶液9 份，每份100 mL，使用枸櫞酸調(diào)節(jié)不同pH，加入蔗糖調(diào)節(jié)不同水活度。添加抑菌劑苯甲酸鈉（濃度以酸計(jì)）使?jié)舛确謩e為0.15%、0.20%、0.25%。具體數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 自制樣品信息及抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 菌懸液的制備 取魯氏酵母、白色念珠菌、黑曲霉分別接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)48 h，作為新鮮培養(yǎng)物；魯氏酵母、白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至濃度分別為106cfu/mL 和107cfu/mL 的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)1 周后用含0.05 %聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成含孢子數(shù)107cfu/mL 的孢子懸液。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌分別接種至胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)24 h，作為新鮮培養(yǎng)物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至濃度均為108cfu/mL 的菌懸液。

2.2 水活度測(cè)定

分別取“1.4”和“2.1.1”項(xiàng)下市售和自制強(qiáng)力枇杷露在25 ℃條件下用水活度儀測(cè)定水活度，每份樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。結(jié)果見表1、表2。

2.3 方法適用性試驗(yàn)

對(duì)9 批次強(qiáng)力枇杷露進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，不同企業(yè)的強(qiáng)力枇杷露均可使用以下方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，六株菌的回收率均在0.8 以上，符合《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則1105 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法的要求。在該方法下，能有效檢出強(qiáng)力枇杷露中的含菌數(shù)。具體方法見表3。

表3 強(qiáng)力枇杷露微生物方法學(xué)

2.4 抑菌效力測(cè)定

每批樣品取6 支試管，每支試管加入樣品9.9 mL，再分別加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、魯氏酵母、白色念珠菌、黑曲霉0.1 mL，充分混勻，使試驗(yàn)菌在樣品中分布均勻，接種后的樣品中染菌量為105～107cfu/mL。接種后樣品避光，置25 ℃培養(yǎng)箱中。9 批次市售強(qiáng)力枇杷露和9 批次自制樣品在接種后0 d、14 d、28 d 分別取樣，對(duì)菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則1121 抑菌效力檢查法中口服制劑：細(xì)菌在接種后14 d 下降3 個(gè)lg 值，至28 d 時(shí)無(wú)增長(zhǎng)；真菌在接種后14 d 下降1 個(gè)lg 值，至28 d 時(shí)無(wú)增長(zhǎng)。

2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 市售樣品的抑菌效力 9 批次強(qiáng)力枇杷露均通過(guò)抑菌效力挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)，在接種后14 d 細(xì)菌和真菌均為0，lg值均下降5～7，且在28 d時(shí)細(xì)菌和真菌均為0，lg 值均未增加。

2.5.2 自制樣品的抑菌效力 抑菌效力考察結(jié)果顯示，9 批次自制樣品共有5 批次通過(guò)抑菌效力挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。苯甲酸鈉（以酸計(jì)）添加量0.25%時(shí)，3 批次自制樣品均通過(guò)挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)；添加量0.20%時(shí)，其中2 批次通過(guò)挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)（pH6.5，水活度0.967 1 時(shí)1 批次未通過(guò)挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)）；添加量0.15%時(shí)，3 批次自制樣品均未通過(guò)挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。具體詳見圖1。

圖1 自制樣品9批次對(duì)6株菌的影響

3 討論

3.1 不同有效期對(duì)抑菌效力的影響

同一企業(yè)3 批次不同有效期（生產(chǎn)3 個(gè)月內(nèi)1 批、距離保質(zhì)期一年1 批、保質(zhì)期3 個(gè)月內(nèi)1 批）強(qiáng)力枇杷露均通過(guò)抑菌效力考察，且3 批次樣品在14 d內(nèi)需氧菌和真菌均未有生長(zhǎng)。說(shuō)明強(qiáng)力枇杷露在保質(zhì)期內(nèi)抑菌劑濃度變化不大，抑菌效力受有效期影響不大。

3.2 pH 值對(duì)抑菌效力的影響

9 批次不同pH 值的市售樣品，均通過(guò)抑菌效力考察。但是在自制樣品中，pH 值與苯甲酸鈉的濃度對(duì)抑菌效力的影響較為明顯。當(dāng)陰性樣品pH低于4.5 時(shí)，苯甲酸鈉（以酸計(jì)）添加濃度為0.20%即可通過(guò)抑菌效力檢查，表明抑菌劑的抑菌效力受pH 影響較大。提示在苯甲酸鈉（以酸計(jì)）添加濃度在一定范圍時(shí)，pH 對(duì)液體制劑中的苯甲酸鈉的抑菌效力起主導(dǎo)作用，抑菌劑苯甲酸鈉的有效抑菌取決于其非解離狀態(tài)，與制劑的pH 息息相關(guān)。苯甲酸鈉的最佳使用pH 在2.5～4.5 之間，pH 大于5幾乎無(wú)抗菌活性。抑菌體系中抑菌劑苯甲酸鈉的抑菌活性與自制樣品的pH 成反比關(guān)系，一定范圍內(nèi)，制劑的pH 越低，苯甲酸鈉抑菌效果越好［6-7］。

3.3 水活度對(duì)抑菌效力的影響

口服液體制劑的水活度較高，且根據(jù)處方工藝的不同，不同企業(yè)不同制劑水活度相差也較大。本研究中幾批次強(qiáng)力枇杷露的水活度在0.95～0.97 之間，隨著水活度的增加，不同菌的生長(zhǎng)速率也有很大增長(zhǎng)，尤其是在對(duì)制劑pH 做出調(diào)整之后，水活度對(duì)制劑的抑菌效力影響很大。能否利用水活度的概念來(lái)控制中藥制劑中微生物的增長(zhǎng)是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)［8-9］。表4 為常見6 株菌生長(zhǎng)所需的最低水活度。

表4 菌株生長(zhǎng)所需的最低水活度

苯甲酸鈉是藥品中常用的安全、低毒、高效抑菌劑，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、致病酵母菌和霉菌均具有良好的抑制作用。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)力枇杷露的抑菌體系的構(gòu)建較為合理，能較好地抵御微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。不過(guò)該抑菌體系依然存在可以優(yōu)化的地方，結(jié)合藥物的理化性質(zhì)在一定pH 范圍內(nèi)控制水活度，可以減少抑菌劑的添加量以達(dá)到更好的抑菌效力。