宇芙蓉 方佩斐 施 維 金 郁

當(dāng)前，湖沼地區(qū)和山丘地區(qū)為我國(guó)血吸蟲(chóng)病的防治重點(diǎn)地區(qū)。安徽位于長(zhǎng)江中下游地區(qū)，是我國(guó)血吸蟲(chóng)病流行最嚴(yán)重的湖區(qū)五省之一，流行區(qū)主要分布在皖江兩岸，皖南山區(qū)和高郵湖畔[1]。自然界中生物的遺傳變異普遍存在，DNA水平上的分子遺傳學(xué)技術(shù)成為研究生物分類(lèi)，判斷物種基因型別的重要方法。其中日本血吸蟲(chóng)的核糖體DNA第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS2）序列因?yàn)槠溥M(jìn)化速度快，種間變異明顯大于種內(nèi)變異，被作為有效的分子標(biāo)記廣泛用于種內(nèi)變異的判斷依據(jù)，而日本血吸蟲(chóng)的線(xiàn)粒體DNA（mtDNA）作為一種核外遺傳物質(zhì)，同樣也是寄生蟲(chóng)群體遺傳研究中一種較好的遺傳標(biāo)志，它進(jìn)化速度快、群體內(nèi)變異大，嚴(yán)格的母系遺傳，具有高度均一性，非常有利于進(jìn)行群體遺傳分析。基于nadl、cox1和ITS2的PCR-RFLP技術(shù)是研究日本血吸蟲(chóng)的種群遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性的一種有用的遺傳標(biāo)記，簡(jiǎn)便、快速，成本低[2]。本研究采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCRRFLP）技術(shù)，對(duì)安徽省山丘型流行區(qū)（石臺(tái)）和南京地區(qū)日本血吸蟲(chóng)的核糖體DNA第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS2）基因和線(xiàn)粒體DNA（mtDNA）細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（mtDNA-COX1）基因進(jìn)行種群遺傳多態(tài)性分析，闡明安徽省山丘型流行區(qū)與其他地區(qū)日本血吸蟲(chóng)基因型差異，分析不同基因型日本血吸蟲(chóng)造成宿主損傷的差異，以有助于分析日本血吸蟲(chóng)種群遺傳結(jié)構(gòu)、群體遺傳多樣性及親緣關(guān)系，深入了解日本血吸蟲(chóng)傳播特征，為今后控制日本血吸蟲(chóng)病的流行提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只6~8周雌性野生型C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18~20 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)（24 ℃，55%濕度）[3]。

1.1.2 釘螺收集 ①實(shí)驗(yàn)組：以安徽省池州市石臺(tái)杜村為試點(diǎn)，現(xiàn)場(chǎng)采集釘螺，在實(shí)驗(yàn)室用常規(guī)法篩選出感染性釘螺。②對(duì)照組：從南京市疾病預(yù)防控制中心購(gòu)買(mǎi)陽(yáng)性釘螺[4]。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 ATC201型DNA擴(kuò)增儀、DK-8D 型電熱恒溫水槽、JD-801凝膠成像分析系統(tǒng)、Power Pacl000電泳儀，離心機(jī)、PCR引物由上海通用生物有限公司合成，DNA提取試劑，ALT轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)試劑。

1.2 方法

1.2.1 感染方法 將從安徽石臺(tái)地區(qū)采集到的釘螺帶回實(shí)驗(yàn)室，逸蚴篩選陽(yáng)性釘螺并繼續(xù)飼養(yǎng)，2周后對(duì)釘螺再次進(jìn)行逸蚴，收集石臺(tái)組尾蚴；將從南京市疾病預(yù)防控制中心購(gòu)買(mǎi)陽(yáng)性釘螺放置在25 ℃光照下逸出尾蚴，收集南京組尾蚴。逸出的尾蚴采用腹部貼片法（15 min）感染C57BL/6小鼠，每只小鼠感染（20±2）只尾蚴，其中石臺(tái)組尾蚴感染15只小鼠，南京組尾蚴感染15只小鼠。兩組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)至尾蚴感染35天后，門(mén)靜脈灌注法分離和收集成蟲(chóng)。單只成蟲(chóng)收集于1.5 mL離心管（內(nèi)有95%乙醇），-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 成蟲(chóng)DNA提取 將收集到的日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，0.01 mol/L PBS洗滌3次，用DNA提取試劑盒提取血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)基因組DNA，在-20 ℃低溫保存；同時(shí)，對(duì)感染小鼠眼球采血，置于1.5 mL EP管中，37 ℃放置30 min，4 ℃，6000 rpm離心10 min，按50 μL/支分裝，-80 ℃保存；無(wú)菌收集小鼠肝臟樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 血吸蟲(chóng)DNA片段擴(kuò)增 PCR參照文獻(xiàn)中[5-6]的分型標(biāo)志物基因特異性引物ITS2和COX 1，以收集的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血吸蟲(chóng)基因組DNA為模板，擴(kuò)增2個(gè)基因片段。反應(yīng)體系如下：血吸 蟲(chóng)DNA模 板1.5 L，ITS2上 游 引 物F：5-GCA TCG ATGAAGAACGCAGC-3和 下 游 引 物R：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3各1 L，COX1上游引物F：5-TCTTTRGATCATAAGCG-3和下游引物R：5-TAA TGCATMGGA AAAAAA CA-3各1 L，PCR Premix Taq 25 L，總體積為50 μL。94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4 RFLP-PCR基因分型 將兩種血吸蟲(chóng)的PCR產(chǎn)物分別用Taq I限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切消化。RFLP反應(yīng)包括2 L限制性?xún)?nèi)切酶特異性緩沖液、1 L DNase、1 L無(wú)酶水、1 L牛血清白蛋白、1 L限制性?xún)?nèi)切酶和15 L PCR產(chǎn)物。為了防止反應(yīng)混合物在反應(yīng)管內(nèi)蒸發(fā)，在每個(gè)反應(yīng)管上加一層礦物油。然后在限制性?xún)?nèi)切酶特定溫度（Taq I為65 ℃）下孵育4 h，之后加入1 L的限制性?xún)?nèi)切酶，反應(yīng)孵育過(guò)夜以確保完全消化。然后將整個(gè)消化反應(yīng)混合物裝入2%的瓊脂糖凝膠中，并在80 mV下進(jìn)行一個(gè)半小時(shí)的電泳后觀察時(shí)間結(jié)果。

1.2.5 病理學(xué)分析（小鼠肝臟石蠟切片HE染色） 將兩組小鼠的肝臟樣本進(jìn)行組織脫水、石蠟包埋、制成5 μm切片后，脫蠟至水。HE染色：蘇木素染色10 min，將肝臟樣本胞核變藍(lán)為止，自來(lái)水流水沖洗1 min；1%鹽酸酒精分化30 s；自來(lái)水流水沖洗15 min以上；1%伊紅酒精染5 min；自來(lái)水沖洗片刻；95%酒精30 s；無(wú)水酒精1 min，二甲苯5 min，烘干，中性樹(shù)脂封片[7]。

1.2.6 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測(cè) 將小鼠眼球血離心后進(jìn)行分離，收集血清，分別檢測(cè)石臺(tái)組和南京組小鼠血清中ALT水平，ALT檢測(cè)試劑購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司，96T微板法，測(cè)定時(shí)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品檢測(cè)孔，空白對(duì)照孔，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，利用兩側(cè)不配對(duì)的Student's t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 倫理批準(zhǔn) 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)和倫理學(xué)委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定（倫理批準(zhǔn)號(hào)Syxk-2017-006）。

2 結(jié) 果

2.1 ITS2和COX1基因PCR結(jié)果 參照文獻(xiàn)中的分型標(biāo)志物基因ITS2和COX 1設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)兩個(gè)地區(qū)的血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。兩組ITS2基因均在500 bp有條帶顯示，兩組COX1基因均在1400 bp有條帶顯示，如圖1A和B。

圖1 日本血吸蟲(chóng)ITS2和COX1基因RFLP-PCR基因分型結(jié)果

2.2 RFLP-PCR基因分型結(jié)果 將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行Taq I限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切后，檢測(cè)到清晰的條帶模式，可以區(qū)分石臺(tái)組和南京組（見(jiàn)圖1）。ITS2經(jīng)Taq I酶切后，石臺(tái)組和南京組的酶切圖譜結(jié)果相同，在約250 bp，150 bp，100 bp處有3條帶。然而，COX1經(jīng)Taq 1酶切后，圖譜結(jié)果不相同，石臺(tái)組在1000 bp處有一條明顯的條帶，而南京組此處無(wú)條帶。見(jiàn)圖1所示。

2.3 石臺(tái)組和南京組小鼠的肝臟肉芽腫大小以及血清ALT比較 HE染色結(jié)果，兩組小鼠的肝臟表面布滿(mǎn)大量大小不一，質(zhì)地較硬的顆粒。鏡下見(jiàn)大量的血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫，周?chē)写罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)。但不同地區(qū)的兩組血吸蟲(chóng)在小鼠肝臟單個(gè)肉芽腫的大小無(wú)明顯差異（石臺(tái)組：4.022×104μm2，南 京 組：3.972×104μm2，P＞0.05），見(jiàn) 圖2。此外，兩組的血清ALT同樣也無(wú)明顯差異（石臺(tái)組：102.496 IU/L，南京組：99.29 IU/L，P＞0.05）。

圖2 石臺(tái)組和南京組小鼠肝臟肉芽腫及血清ALT表現(xiàn)

3 討 論

安徽省石臺(tái)縣是典型的山丘型血吸蟲(chóng)病的流行區(qū)，劉效萍等[8]在2013年以安徽石臺(tái)縣杜村（山區(qū)）和以安徽省安慶市山口鎮(zhèn)村（湖區(qū)）為調(diào)查點(diǎn)，開(kāi)展人畜及野生動(dòng)物病原學(xué)查病，發(fā)現(xiàn)安慶市山口鎮(zhèn)村日本血吸蟲(chóng)病人的感染率為2.81%；牛的感染率為27.27%。牛排出的蟲(chóng)卵數(shù)占當(dāng)?shù)厝张畔x(chóng)卵數(shù)的97.88%。石臺(tái)縣杜村感染血吸蟲(chóng)病人的感染率僅為1.25%，野鼠的感染率為12.24%。野鼠排出的蟲(chóng)卵數(shù)占當(dāng)?shù)厝张畔x(chóng)卵數(shù)的99.67%，人僅占0.32%。另王素蓉[9]有實(shí)驗(yàn)證實(shí)自然光照周期下，山區(qū)感染性釘螺體內(nèi)日本血吸蟲(chóng)尾蚴逸出高峰時(shí)段為下午17:00~21:00，表現(xiàn)為“晚逸蚴”，表明當(dāng)?shù)氐年?yáng)性釘螺自然狀況下多在夜間逸出尾蚴，這也與教科書(shū)上釘螺在一定溫度、要有光照、白天逸蚴的生物學(xué)行為相悖。

采用PCR-RFLP對(duì)安徽省石臺(tái)縣日本血吸蟲(chóng)種群遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，通過(guò)與其他地區(qū)日本血吸蟲(chóng)的基因比較，可闡明當(dāng)?shù)厝毡狙x(chóng)與其他地區(qū)日本血吸蟲(chóng)的基因型差異，最終鑒別何種原因造成日本血吸蟲(chóng)宿主易感性變異。在真核生物中，核糖體DNA轉(zhuǎn)錄區(qū)間即rDNA-ITS（ITS1和ITS2）系列由于進(jìn)化速度快，種間變異明顯大于種內(nèi)變異，已經(jīng)證明可用于種內(nèi)變異的判斷依據(jù)。此外，線(xiàn)粒體DNA序列（mtDNA）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單穩(wěn)定，可以作為有效的遺傳分子標(biāo)記[10]，用于種群分類(lèi)或示蹤相關(guān)個(gè)體特殊種群的基因發(fā)展歷史，廣泛用于寄生蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定。

本實(shí)驗(yàn)研究安徽石臺(tái)縣日本血吸蟲(chóng)的核糖體DNA第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS2）基因和線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基（mtDNA-COX1）基因的遺傳變異，結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增出石臺(tái)縣和南京日本血吸蟲(chóng)的rDNA-ITS2片段，大小相同，均為500 bp左右，經(jīng)Taq I酶切后，ITS2經(jīng)Taq I酶切后，石臺(tái)組和南京組的酶切圖譜結(jié)果相同，在約250 bp、150 bp、100 bp處有3條帶；也成功擴(kuò)增出石臺(tái)組和南京組的日本血吸蟲(chóng)COX1片段，大小均為1400 bp左右，然而，COX1經(jīng)Taq I酶切后，結(jié)果卻不相同，石臺(tái)組在1000 bp處有一條明顯的條帶，而南京組此處無(wú)條帶，由此判斷石臺(tái)組與南京組血吸蟲(chóng)在COX1基因片段上存在差異。石臺(tái)縣屬于山丘型流行區(qū)，目前有大量感染血吸蟲(chóng)的陽(yáng)性釘螺存在，但是人類(lèi)的感染率卻很低。從蟲(chóng)種的基因角度而言，石臺(tái)組與南京組的日本血吸蟲(chóng)基因組存在遺傳變異。本研究結(jié)果也顯示，兩種蟲(chóng)體感染小鼠后，小鼠的肝臟纖維化病理結(jié)果與轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定結(jié)果相似，說(shuō)明石臺(tái)組和南京組的日本血吸蟲(chóng)致病性并無(wú)差異。這一遺傳差異的原因是否與人類(lèi)對(duì)血吸蟲(chóng)的易感性有關(guān)尚有待進(jìn)一步研究。

日本血吸蟲(chóng)病是一種對(duì)人體危害較大的寄生蟲(chóng)病，本課題利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)蟲(chóng)體rDNAITS2和COX1進(jìn)行基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩地日本血吸蟲(chóng)的線(xiàn)粒體基因COX1序列存在著差異，這將有助于我們深入了解當(dāng)?shù)匮x(chóng)的傳播特征，為后期研究日本血吸蟲(chóng)的種群遺傳、多樣性分析結(jié)構(gòu)提供新數(shù)據(jù)，同時(shí)也為血吸蟲(chóng)病的防治提供新思路。