胡佳麗,曹 卉,雷 茹,崔 娟,崔 婧 （.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液凈化科，河北 張家口 075000；.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北 張家口 075000）

急性腎損傷是全球性的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率和病死率均較高[1]。急性腎損傷表現(xiàn)為腎功能迅速下降，血漿電解質(zhì)、血液動(dòng)力學(xué)、營養(yǎng)和水的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破[2]。除了透析，目前尚無其他有效可靠的方法治療急性腎損傷[3]。因此，尋找有效的治療劑非常有必要。急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及腎小管、微血管和炎癥等，這些機(jī)制可能相互作用并相互放大[3]。以往的研究表明，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可能引起細(xì)胞因子風(fēng)暴、氧化應(yīng)激加劇、低血壓、腎灌注不足，最終導(dǎo)致腎功能逐漸下降[4]。Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）是LPS的主要受體，其與LPS結(jié)合后被激活，并誘導(dǎo)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)以及炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[3]。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）是NOD樣受體家族最重要的成員之一。越來越多的研究表明，NLRP3炎性小體對(duì)急性腎損傷的發(fā)展至關(guān)重要[5-7]。甘草素是從甘草中提取的一種多酚類黃酮化合物結(jié)構(gòu)體，具有抗炎、保肝、調(diào)血脂、抗氧化、抗癌和調(diào)節(jié)雌激素等多種生化和藥理特性[8]，其可通過抑制NF-κB和NLRP3炎性小體通路減輕高葡萄糖誘導(dǎo)的系膜基質(zhì)積聚、氧化應(yīng)激和炎癥[9]。但目前甘草素對(duì)急性腎損傷的作用尚不清楚。因此，本研究探討甘草素對(duì)急性腎損傷進(jìn)展的影響和相關(guān)作用機(jī)制，以期為急性腎損傷的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

甘草素（批號(hào)：21031707）購自MCE中國；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號(hào)：20112013）購自北京索萊寶科技有限公司；One Step PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（批號(hào)：51173026）購自大連寶生物公司；Power SYBR Green PCR Master Mix（批號(hào)：4367659）購自美國ABI公司；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑（批號(hào)：190316）、RIPA裂解液（批號(hào)：200708）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：200122）和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)：210118）購自上海碧云天生物有限公司；p-NF-κBp65（批號(hào)：3033）、NF-κBp65（批號(hào)：3034）、p-IκBα（批號(hào)：2859）、IκBα（批號(hào)：4812）和 TLR4（批號(hào)：14358）一抗購自美國CST公司；NLRP3（批號(hào)：263899）、Caspase-1（批號(hào)：138483）、IL-1β（批號(hào)：234437）一抗和辣根過氧化物酶（horseradish peroxi?dase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)：205718）購自英國Abcam公司。TC6010L全自動(dòng)生化分析儀（江西特康科技有限公司）；RX51光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；NanoDrop 2000分光光度計(jì)、Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀和Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（美國ThermoFisher公司）；Chemi?DocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性昆明小鼠48只購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（冀）2018-004]，飼養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，濕度50%~60%，明暗循環(huán)12 h，自由進(jìn)食和飲水。本研究獲河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.2022007）。

1.3 分組及給藥

雄性昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組、LPS+甘草素3.75 mg/kg組、LPS+甘草素7.5 mg/kg組、LPS+甘草素15 mg/kg組、LPS+地塞米松組，每組8只。LPS+甘草素3.75 mg/kg組、LPS+甘草素7.5 mg/kg組、LPS+甘草素15 mg/kg組、LPS+地塞米松組小鼠每天分別腹腔注射3.75、7.5、15 mg/kg甘草素和5 mg/kg地塞米松，持續(xù)5 d；對(duì)照組和LPS組給予等量生理鹽水2 mL/100 g。最后一次給藥后1 h，除對(duì)照組外，所有小鼠均腹腔注射LPS（10 mg/kg）；而對(duì)照組小鼠僅注射生理鹽水。24 h后，將所有小鼠用戊巴比妥鈉麻醉，摘掉眼球取血，并在4 °C下以3 500 r/min離心10 min，收集血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐和尿素氮水平。然后頸脫位處死小鼠，收集腎組織。

1.4 HE染色觀察腎組織病理變化

腎組織在4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，石蠟包埋并切片，厚度約4 μm，分別用蘇木素和伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化。

1.5 qRT-PCR分析腎組織中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）和腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）的mRNA表達(dá)

使用TRIzol試劑提取腎組織總RNA。使用Nano?Drop 2000測(cè)定mRNA濃度。使用One Step PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。以cDNA為模板，使用Power SYBR Green PCR Master Mix和Applied Biosystems 7500進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。以GAPDH為參考基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 ELISA檢測(cè)腎組織炎癥因子水平

按照ELISA試劑盒操作說明書，測(cè)定腎組織中TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的含量，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

將腎組織在液氮中儲(chǔ)存，取出研磨成粉末，加入RIPA裂解液于冰上裂解，于4 ℃下以10 000 r/min離心10 min后，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)樣品取20 μg總蛋白上樣到12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠孔中，100 V電泳分離1 h，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。室溫下在5%脫脂牛奶中封閉 2 h 后，將膜與NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、p-NF-κBp65（1∶1 000）、NF-κBp65（1∶1 000）、p-IκBα（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）、TLR4（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗于37 ℃孵育1 h，使用ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，用Image-Pro Plus軟件確定蛋白條帶的灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用Student'st檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色組織病理學(xué)觀察

與對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷模型小鼠的腎組織中有大量炎癥細(xì)胞浸潤。與LPS組相比，LPS+甘草素7.5 mg/kg組、LPS+甘草素15 mg/kg組、LPS+地塞米松組中炎癥細(xì)胞浸潤減少，見圖1。

圖1 腎組織HE染色（×400）

2.2 血清肌酐和尿素氮水平

與對(duì)照組相比，LPS組小鼠血清肌酐和尿素氮水平均顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，LPS+甘草素7.5 mg/kg組、LPS+甘草素15 mg/kg組、LPS+地塞米松組中小鼠血清肌酐和尿素氮水平均顯著下調(diào)（P<0.05），見表2。

表2 血清肌酐和尿素氮水平（，n=8，mg/dL）

表2 血清肌酐和尿素氮水平（，n=8，mg/dL）

*：與對(duì)照組相比，P<0.01；#：與LPS組相比，P<0.05；△：與LPS組相比，P<0.01

尿素氮10.72±3.56 37.91±5.47*34.05±5.18 25.33±4.74△13.75±4.08△11.79±3.16△組別對(duì)照組LPS組LPS +甘草素3.75 mg/kg組LPS +甘草素7.5 mg/kg組LPS +甘草素15 mg/kg組LPS +地塞米松組肌酐0.35±0.07 1.25±0.38*1.16±0.27 0.83±0.21#0.45±0.18△0.41±0.11△

2.3 腎損傷標(biāo)志物NGAL和KIM-1 mRNA水平

與對(duì)照組相比，LPS組小鼠NGAL和KIM-1 mRNA水平均顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，LPS+甘草素7.5 mg/kg組、LPS+甘草素15 mg/kg組、LPS+地塞米松組中小鼠NGAL和KIM-1 mRNA水平均顯著下調(diào)（P<0.01），見表3。

表3 腎損傷標(biāo)志物NGAL和KIM-1 mRNA水平（，n=8）

表3 腎損傷標(biāo)志物NGAL和KIM-1 mRNA水平（，n=8）

*：與對(duì)照組相比，P<0.01；#：與LPS組相比，P<0.01

組別對(duì)照組LPS組LPS+甘草素3.75 mg/kg組LPS+甘草素7.5 mg/kg組LPS+甘草素15 mg/kg組LPS+地塞米松組KIM-1 1.00±0.00 42.19±6.52*39.46±4.59 26.41±5.06#12.29±3.48#7.53±2.46#NGAL 1.00±0.00 516.58±89.17*497.61±77.92 367.18±58.34#184.26±37.09#91.06±16.73#

2.4 腎組織中炎癥因子水平

與對(duì)照組相比，LPS組小鼠腎組織中炎癥因子水平均顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，LPS+甘草素7.5 mg/kg組、LPS+甘草素15 mg/kg組、LPS+地塞米松組小鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著下調(diào)（P<0.05），見表4。

表4 腎組織中炎癥因子水平（，n=8，pg/mg）

表4 腎組織中炎癥因子水平（，n=8，pg/mg）

*：與對(duì)照組相比，P<0.01；#：與LPS組相比，P<0.05；△：與LPS組相比，P<0.01

TNF-α 80.62±2.27 140.34±7.28*137.05±7.66 109.17±5.89#83.29±6.07△78.75±5.65△組別對(duì)照組LPS組LPS+甘草素3.75 mg/kg組LPS+甘草素7.5 mg/kg組LPS+甘草素15 mg/kg組LPS+地塞米松組IL-6 101.20±3.91 165.74±7.25*159.89±8.67 134.54±5.62#121.82±6.40△119.17±5.37△IL-1β 64.69±3.49 138.09±8.27*132.53±10.38 105.48±4.64#83.16±5.45△77.51±6.34△

2.5 腎組織中TLR4、p-IκBα和p-NF-κBp65水平

與對(duì)照組相比，LPS組小鼠腎組織中TLR4、p-IκBα/IκBα 和 p-NF-κBp65/NF-κBp65 均顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，LPS+甘草素7.5 mg/kg組、LPS+甘草素15 mg/kg組、LPS+地塞米松組小鼠腎組織中 TLR4、p-IκBα/IκBα 和 p-NF-κBp65/NF-κBp65 均顯著下調(diào)（P<0.05），見圖2。

圖2 腎組織中TLR4、p-IκBα和p-NF-κBp65水平

2.6 腎組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β水平

與對(duì)照組相比，LPS組小鼠腎組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，LPS+甘草素7.5 mg/kg組、LPS+甘草素15 mg/kg組、LPS+地塞米松組小鼠腎組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P<0.05），見圖3。

圖3 腎組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β水平

3 討論

急性腎損傷是一種由多種因素引起的臨床綜合征，其特點(diǎn)是腎功能迅速下降[10-11]。已有研究證實(shí)甘草素能顯著逆轉(zhuǎn)血清和尿液中促炎細(xì)胞因子的升高，且主要通過抑制高尿酸血癥大鼠腎NF-κB/IκBα和抑制NLRP3炎性小體激活來改善腎炎癥，具有腎保護(hù)作用[12]。本研究中，小鼠注射LPS后出現(xiàn)腎功能異常，而使用血清尿素氮和肌酐水平升高，甘草素可明顯降低血清尿素氮和肌酐水平，并顯著緩解LPS誘導(dǎo)的病理損傷；此外，甘草素處理后，LPS誘導(dǎo)的腎損傷標(biāo)志物NGAL和KIM-1顯著下調(diào)，這些結(jié)果證實(shí)甘草素在急性腎損傷中具有一定的腎保護(hù)作用。

研究表明，具有抗炎活性的候選藥物可能對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷有益，其中甘草素被證明在各種動(dòng)物模型中能有效抑制炎癥的進(jìn)展[13-14]。由早期促炎細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-1β）過量而引發(fā)的炎癥反應(yīng)失調(diào)可導(dǎo)致膿毒癥晚期的組織損傷和器官功能障礙[15]。本研究中甘草素降低了受損腎組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，也證實(shí)了這一點(diǎn)。

NF-κB通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下游基因，尤其是促炎細(xì)胞因子，對(duì)腎內(nèi)炎癥起關(guān)鍵作用。在未激活時(shí)，NF-κB p65與細(xì)胞質(zhì)中的抑制劑IκBα結(jié)合，當(dāng)受到LPS刺激時(shí)，IκBα被其激酶IKK磷酸化，并通過泛素-蛋白酶體途徑與NF-κBp65分開降解?；罨腘F-κBp65易位進(jìn)入細(xì)胞核，然后作為炎癥基因的轉(zhuǎn)錄激活因子[16]。TLR4是一種模式識(shí)別受體，可充當(dāng)LPS傳感器，其激活會(huì)招募炎癥因子并導(dǎo)致腎損傷。研究表明，NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）通路由細(xì)胞膜中的TLR4二聚體介導(dǎo)[17]。有研究表明，人參皂苷Rb1通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB/MAPKs信號(hào)通路顯著減輕LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷[18]。Chen等[19]的研究表明甘草素可通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝竇內(nèi)皮損傷和炎癥損傷。本研究中，LPS組小鼠腎組織中TLR4、p-IκBα/IκBα 和 p-NF-κBp65/NF-κBp65 的水平均較對(duì)照組顯著升高，LPS+甘草素7.5 mg/kg組和LPS+甘草素15 mg/kg組小鼠腎組織中TLR4、p-IκBα/IκBα和p-NF-κBp65/NF-κBp65的水平均較LPS組顯著下調(diào)。表明甘草素能抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路緩解LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷。

據(jù)報(bào)道，NLRP3炎性小體在急性腎損傷和慢性腎病的發(fā)病中具有重要的作用[19]。一旦NLRP3炎性小體被激活，將導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18等的成熟和釋放[20]。且有研究表明，抑制NLRP3炎性小體途徑激活可減輕各種動(dòng)物模型中的腎損傷[21-22]。Zhu等[9]研究表明，甘草素通過抑制NF-κB和NLRP3炎性小體通路，可減輕高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)積累、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的小鼠腎組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高；而在LPS+甘草素7.5 mg/kg組和LPS+甘草素15 mg/kg組小鼠腎組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)水平均較LPS組顯著下調(diào)。表明甘草素可抑制急性腎損傷小鼠中LPS激活的NLRP3炎癥途徑。

綜上所述，甘草素可改善LPS誘導(dǎo)的腎炎癥和病理損傷，在急性腎損傷小鼠模型中發(fā)揮腎保護(hù)作用，其潛在機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB途徑和NLRP3炎癥途徑有關(guān)。表明甘草素是治療急性腎損傷的潛在候選藥物，但需要更多的研究來探索其具體機(jī)制。