黃 芳，黃明光，黃 涵，張鈺欣，李芳芳，胡傳活*

1.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南寧 530004；2.廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；3.廣西畜牧站，南寧 530022；4.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；5.廣西壯族自治區(qū)畜禽品種改良站，南寧 530001

精子進(jìn)入雌性輸卵管獲得能夠使卵子受精的能力的過程稱為精子獲能[1]。精子除了可以在體內(nèi)獲能外，在體外獲能培養(yǎng)基中培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后也會(huì)發(fā)生獲能反應(yīng)。獲能培養(yǎng)基中含有電解質(zhì)和能量代謝產(chǎn)物（如葡萄糖、丙酮酸和乳酸），這些物質(zhì)能夠保證精子在運(yùn)動(dòng)過程中所需的高ATP 消耗[2]。正常生理過程中，低水平的活性氧（ROS）能介導(dǎo)與精子獲能相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，如精子過度激活、獲能、頂體反應(yīng)以及精子-卵母細(xì)胞結(jié)合等基本生理過程，而過量的ROS 會(huì)導(dǎo)致精子產(chǎn)生氧化應(yīng)激，減少受精潛力以及配子正常胚胎發(fā)育的能力，甚至引起精子凋亡[3-4]。因此，緩解精子獲能過程中的氧化應(yīng)激損傷對(duì)維持體外獲能的精子質(zhì)量十分重要。

α-酮戊二酸（AKG）是三羧酸（TCA）循環(huán)中琥珀酰輔酶A 和異檸檬酸鹽之間的重要中間體，且AKG 具有良好的溶解性，不表現(xiàn)出毒性，其水溶液具有很高的穩(wěn)定性[5]。AKG 作為無氧反應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn)，可轉(zhuǎn)化為丙酮酸和乳酸，也可逆轉(zhuǎn)TCA 循環(huán)產(chǎn)生檸檬酸，能調(diào)節(jié)ATP 的產(chǎn)生，在細(xì)胞能量代謝中起著至關(guān)重要的作用。除了已知的代謝作用外，AKG也是一種潛在的抗氧化劑，在促進(jìn)ATP 產(chǎn)生的同時(shí)減少TCA 循環(huán)中的等效（NAD+/NADH）生成，從而降低ROS 的產(chǎn)生，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)[6-7]。因此，本試驗(yàn)研究添加AKG 對(duì)豬獲能精子糖代謝及抗氧化能力的影響，為體外獲能試驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁├碚摵涂茖W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從廣西貴港秀博基因科技股份有限公司購買12 份性成熟長(zhǎng)白豬精液樣品，精子濃度為4.5×107個(gè)/mL，計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）檢測(cè)活力不低于70%方可用于后續(xù)試驗(yàn)。精子獲能培養(yǎng)液（BWW）購自上海吉美生物醫(yī)藥科技有限公司，精子活體染色試劑盒（伊紅-苯胺黑法）購自北京Solarbio 有限公司，CASA 系統(tǒng)購自法國(guó)卡蘇公司。ATP 含量、乳酸含量、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 精子獲能處理

按照文獻(xiàn)[8]所述，先將豬精液1 500 r/min 離心15 min 后棄去上清，用PBS 洗滌3 次。用BWW 獲能液重懸精子，并調(diào)整精子濃度為5×106～10×106個(gè)/mL。取1 mL 處理好的精液加入10 μL 不同濃度的AKG（5、15、30、45、60 mmol/L）混勻（獲能對(duì)照組添加相同體積的PBS）后置于5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中37 ℃孵育2 h。

1.3 精子活率檢測(cè)

按照說明書的操作步驟，取潔凈小試管，滴加孵育完成的精子樣本10 μL 和等量伊紅染色液，混勻放置15 s，滴加苯胺黑染色液20 μL，混勻靜置30 s。取精液-伊紅-苯胺黑染色液10 μL 于載玻片上，制成涂片。晾干、鏡檢，活精子為白色，死精子呈紅色，400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算白色精子的百分比，每個(gè)樣本至少計(jì)數(shù)200 條精子，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 精子質(zhì)膜完整性檢測(cè)

根據(jù)謝運(yùn)法等[9]的方法將孵育完成后的精子1 000 r/min 離心5 min，棄一部分上清，取100 μL精液置于37 ℃預(yù)熱的低滲溶液中調(diào)整精子濃度為1×106個(gè)/mL，37 ℃孵育30 min。取20 μL 懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算尾巴卷曲的精子百分比。每個(gè)樣本至少計(jì)數(shù)200，計(jì)算條精子，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 頂體完整率檢測(cè)試劑

按照文獻(xiàn)[9]取100 μL 孵育完成后的精子于1 mL 3.7%多聚甲醛溶液中室溫固定30 min，PBS洗滌1 次，加入500 μL 的PBS 制成懸液，取10 μL涂片，室溫環(huán)境下自然干燥。將風(fēng)干后的載玻片置于裝有考馬斯亮藍(lán)的染色缸中染色5 min。用超純水緩慢沖洗載玻片上的染色液，自然晾干后，用中性樹膠封片。400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察精子頂體完整性（頂體呈均勻藍(lán)色，且表面光滑，輪廓清晰的精子為頂體完整的精子），至少計(jì)數(shù)200 個(gè)精子，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

根據(jù)文獻(xiàn)[10]所述方法，提前將CASA 系統(tǒng)的載物臺(tái)預(yù)熱至37 ℃，取2 μL 的精液緩慢滴入一次性精子計(jì)數(shù)池中，通過調(diào)節(jié)不同的視野區(qū)域觀察精子，記錄精子活力及相應(yīng)運(yùn)動(dòng)速率，至少采集500個(gè)精子用作分析，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

研究評(píng)估的CASA 動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括：活力、曲線速度（VCL）、平均路徑速度（VAP）、直線速度（VSL）、頭部擺動(dòng)幅度（ALH）、交叉運(yùn)動(dòng)頻率（BCF）、擺動(dòng)比例（WOB）、線性運(yùn)動(dòng)比例（LIN）、直線運(yùn)動(dòng)比例（STR）。

1.7 精子ATP 含量、乳酸含量、T-AOC、SOD、CAT 活力及MDA 含量的檢測(cè)

各組精子用PBS 洗滌3 次后收集精子沉淀，按照試劑盒操作說明加入提取液，超聲破碎精子后分別加入相應(yīng)的檢測(cè)液，用酶標(biāo)儀和分光光度計(jì)測(cè)定精子的ATP 含量、乳酸含量、T-AOC、SOD、CAT 活力及MDA 含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05 表示差異不顯著。用GraphPad Prism 8.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AKG 對(duì)獲能豬精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整性的影響

由表1 可知，與新鮮精子相比，當(dāng)精子獲能后，精子的活率和質(zhì)膜完整性顯著下降。與獲能對(duì)照組相比，添加不同濃度的AKG 獲能組未對(duì)精子的活率和質(zhì)膜完整性產(chǎn)生顯著影響。新鮮精子組、獲能對(duì)照組和添加AKG 獲能組的頂體完整率之間無顯著差異。

表1 AKG 對(duì)獲能豬精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整性的影響（n=5） %

2.2 AKG 對(duì)獲能豬精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

如表2 所示，與新鮮精子相比，獲能后各組豬精子活力未發(fā)生顯著變化。與新鮮組相比，獲能后各組，除ALH 外，其余各項(xiàng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)均顯著升高。其中，BCF、LIN、STR 在獲能對(duì)照組中最高。AKG 濃度為5 mmol/L 時(shí)，WOB 最高；AKG 濃度為15 mmol/L時(shí)，VCL、VAP、VSL、ALH 最高。

表2 AKG 對(duì)獲能豬精子運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù)的影響（n=5）

2.3 AKG 對(duì)獲能豬精子能量代謝的影響

如圖1 所示，與新鮮精子相比，獲能后各組精子的ATP 和乳酸含量顯著增加。與獲能對(duì)照組相比，AKG 濃度超過5 mmol/L 時(shí)，ATP 含量顯著增加，且AKG 濃度為15 mmol/L 時(shí)含量最高。獲能AKG 處理組的乳酸含量均顯著高于獲能對(duì)照組，且AKG 濃度為15 mmol/L 時(shí)乳酸含量最高。

圖1 AKG 對(duì)獲能豬精子能量代謝的影響

2.4 AKG 對(duì)獲能豬精子抗氧化能力的影響

本試驗(yàn)最適AKG 濃度為15 mmol/L，進(jìn)一步測(cè)定最適濃度處理后抗氧化指標(biāo)的變化（圖2）。與新鮮精子相比，獲能對(duì)照組精子的T-AOC 和SOD 活力未出現(xiàn)顯著變化，CAT 活力顯著降低，而MDA 含量顯著升高。與獲能對(duì)照組相比，15 mmol/L AKG獲能組的T-AOC、SOD 活力和CAT 活力顯著增加，同時(shí)MDA 含量顯著降低。

圖2 AKG 對(duì)獲能豬精子抗氧化能力的影響

3 討 論

3.1 AKG 對(duì)獲能豬精子的運(yùn)動(dòng)速率和能量代謝的影響

精子在獲能和頂體反應(yīng)的過程中會(huì)發(fā)生一系列變化，如膜的流動(dòng)性增加和過度激活[11]。過度激活是精子運(yùn)動(dòng)的一種特殊狀態(tài)，其特征是高振幅、鞭毛運(yùn)動(dòng)的增加及不對(duì)稱、精子頭部側(cè)向移位增加以及非線性運(yùn)動(dòng)，是獲能精子成功穿透透明帶和受精所必需的[12]。過度激活的豬精子的運(yùn)動(dòng)速率依賴于氧化磷酸化，即需要線粒體產(chǎn)生大量的ATP。研究可見，AKG 通過促進(jìn)能量代謝增加獲能精子的運(yùn)動(dòng)速率，維持精子的過度激活狀態(tài)。

3.2 AKG 對(duì)獲能豬精子的表觀指標(biāo)和抗氧化能力的影響

精子在氧化磷酸化產(chǎn)生ATP 的過程中，通過位于質(zhì)膜上的NADPH 氧化酶系統(tǒng)/線粒體NADH 依賴性氧化還原酶復(fù)合物產(chǎn)生ROS[13]。細(xì)胞內(nèi)ROS 的濃度取決于ROS 的產(chǎn)生速率與各種抗氧化防御機(jī)制清除速率之間的平衡。當(dāng)總抗氧化能力低于精子產(chǎn)生ROS 的能力時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)[14]。MDA 可以用作分析和監(jiān)測(cè)影響精子的脂質(zhì)過氧化損傷水平的重要生化標(biāo)志物。精子質(zhì)膜中多不飽和脂肪酸含量高，特別容易受到氧化產(chǎn)物的影響，導(dǎo)致膜通透性破壞[15]。研究結(jié)果表明，獲能誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化物導(dǎo)致精子的活率及質(zhì)膜完整性顯著下降。

AKG 在清除生物體中的ROS 方面起著至關(guān)重要的作用。Velvizhi 等[16]研究表明，AKG 可以通過增加SOD、GSH-Px 和CAT 活性來防止脂質(zhì)過氧化，以促進(jìn)脂肪代謝，從而減輕乙醇誘導(dǎo)的肝毒性和醋酸銨誘導(dǎo)的大鼠高氨血癥。研究發(fā)現(xiàn)，在AKG 的存在下，獲能精子的T-AOC、SOD 和CAT 活力顯著升高，MDA 顯著下降，這與Velvizhi 等[16]研究結(jié)果一致。AKG 在促進(jìn)獲能精子產(chǎn)生大量的ATP 及乳酸的同時(shí)，并未導(dǎo)致活率及質(zhì)膜完整性的進(jìn)一步下降，說明AKG 導(dǎo)致過量生成的氧化代謝物被清除，使精子維持正常的獲能生理狀態(tài)。

在精子獲能液中添加15 mmol/L AKG 可以顯著提高精子的獲能狀態(tài)，并顯著提高獲能過程中的糖代謝及抗氧化能力。