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        多聚磷酸鹽聚合酶VTC復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能*

        2023-05-16 07:52:50
        關(guān)鍵詞:液泡跨膜復(fù)合體

        劉 偉 葉 升

        (天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津 300072)

        磷在生命活動(dòng)中扮演核心角色,它是生物遺傳物質(zhì)核酸和細(xì)胞膜磷脂的重要組成成分,是生物細(xì)胞能量代謝的載體物質(zhì)三磷酸腺苷(ATP)的結(jié)構(gòu)元素,還是動(dòng)物骨骼和牙齒的主要成分。自然界中大多數(shù)磷以不溶性的無機(jī)磷存在于礦物、土壤、巖石中,只有少量的可溶性磷,主要以無機(jī)磷酸鹽(Pi)的形式為生命所利用。細(xì)胞對磷酸鹽的需求隨著細(xì)胞生理情況的變化而變化,在細(xì)胞分裂間期的S 期因DNA 復(fù)制而達(dá)到峰值。然而磷酸鹽是所有核苷酸降解反應(yīng)的產(chǎn)物,細(xì)胞質(zhì)中過量的磷酸鹽會(huì)改變核苷酸降解反應(yīng)的平衡,降低反應(yīng)的自由能,從而影響相關(guān)的細(xì)胞生理。細(xì)胞質(zhì)磷酸鹽供應(yīng)不足會(huì)影響細(xì)胞的生長和分裂,而磷酸鹽過量則會(huì)抑制細(xì)胞生理活動(dòng)從而對細(xì)胞造成傷害。因此,細(xì)胞需要維持細(xì)胞質(zhì)中磷酸鹽的穩(wěn)態(tài),在滿足自身對磷酸鹽需求的同時(shí)防止細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生過多的磷酸鹽對細(xì)胞造成傷害。磷酸鹽穩(wěn)態(tài)在所有生物體中都是一個(gè)受嚴(yán)格調(diào)控的過程,其功能障礙會(huì)導(dǎo)致人類腎范科尼綜合征(Fanconi syndrome)[1]、植物生長遲緩[2-3]和微生物致死[4]等多種功能紊亂。

        生物體從多個(gè)層次維持機(jī)體的磷酸鹽穩(wěn)態(tài)。在機(jī)體層面,多細(xì)胞生物(如人類)可以通過腎臟的過濾和重吸收維持體液循環(huán)中的Pi濃度[5-6]。他們可以獲取骨骼中的磷灰石作為巨大的Pi儲(chǔ)備。同時(shí),人類組織在質(zhì)膜中廣泛表達(dá)受調(diào)節(jié)的Pi輸出者(XPR1)[7],這表明它們也可能保持對胞漿Pi峰值的保護(hù)。有趣的是,XPR1 也被發(fā)現(xiàn)與Pi在腎臟腎小管的重吸收有關(guān)[1]。對于植物來說,植物生長需要大量的Pi,但大多數(shù)土壤中的Pi水平是有限的,并且不斷變化[8]。為了在自然界中生存克服這種Pi營養(yǎng)“脅迫”,植物不僅進(jìn)化出了強(qiáng)大的Pi吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力,還進(jìn)化出了復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制[9],將多余的Pi儲(chǔ)存在液泡中,以應(yīng)對土壤Pi的變化狀態(tài)。事實(shí)上,大部分(>90%)游離的Pi儲(chǔ)存在植物細(xì)胞的典型液泡中[10]。在單細(xì)胞生物如釀酒酵母中,Pi的感知、獲取和儲(chǔ)存主要由磷酸響應(yīng)信號通路(稱為PHO 通路)介導(dǎo)[11]。在Pi缺乏的情況下,PHO 操縱子被觸發(fā),該操縱子控制一組旨在提高Pi攝入和Pi利用的基因。在釀酒酵母中,Pi獲取系統(tǒng)由4個(gè)定位在細(xì)胞膜的Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組成,其中2個(gè)低親和力Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì),即Pho87、Pho90普遍表達(dá)[12],而2 種高親和力Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pho84 和Pho89 由PHO 途徑調(diào)節(jié)[13]。最初被認(rèn)為是低親和力Pi攝取系統(tǒng)的Pho91 最近被證明位于液泡膜上,并參與將Pi從液泡輸出到細(xì)胞質(zhì)[14]。有趣的是,Pho87、Pho90 和Pho91 都具有SPX 結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域通常存在于參與調(diào)節(jié)Pi穩(wěn)態(tài)的蛋白質(zhì)中[15]。

        為了在Pi的生物合成需求和胞質(zhì)Pi濃度過高的風(fēng)險(xiǎn)之間實(shí)現(xiàn)微妙的平衡,細(xì)胞以無機(jī)多聚磷酸鹽(polyP)的形式將Pi儲(chǔ)存在膜結(jié)合的酸鈣小體樣細(xì)胞器中[16]。酸鈣小體是從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物都保守的一類膜結(jié)合細(xì)胞器,但其功能尚不清楚。酵母細(xì)胞有一個(gè)類似的酸鈣小體樣細(xì)胞器,即液泡,它攜帶所有集中在酸鈣小體中化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[17]。polyP 是由數(shù)十至數(shù)百個(gè)正磷酸鹽殘基通過高能磷酸酐鍵連接而成,存在于所有生物中。polyP 參與真核生物中的許多過程,包括激活炎癥反應(yīng)[18-19]、促進(jìn)血液凝固[20]、促進(jìn)軟骨的發(fā)育和再生[21]、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[22]、蛋白質(zhì)多聚磷酸化修飾[23]以及調(diào)節(jié)離子通道活性[24]等。polyP 儲(chǔ)存在酸性鈣小體管腔中,同時(shí)多磷酸酶(Ppn1/Ppn2)也位于該管腔中。假設(shè)這些酶可以水解polyP,這可能允許釋放的Pi再輸出進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[25-26]。因此,酸鈣小體樣細(xì)胞器可能是胞漿Pi的重要緩沖裝置。

        釀酒酵母液泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白伴侶(vacuolar transporter chaperone,VTC)復(fù)合體作為已知的真核生物多聚磷酸鹽聚合酶,利用ATP在胞質(zhì)中合成polyP,并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中儲(chǔ)存起來以維持細(xì)胞內(nèi)Pi穩(wěn)態(tài)。近年來,隨著VTC 復(fù)合體的聚合酶和轉(zhuǎn)位酶功能被鑒定[27-28],polyP 合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制也被確定[29]。雖然目前已經(jīng)獲得了一些結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)[27-28],但是有限的信息限制了生理狀態(tài)下VTC 復(fù)合體的組裝、調(diào)控以及激活機(jī)制的研究。最近發(fā)表的完整VTC 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)極大地推動(dòng)了對VTC復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能的理解。

        1 VTC復(fù)合體的研究現(xiàn)狀

        釀酒酵母VTC 復(fù)合體包含了至少4 個(gè)亞基:Vtc1、Vtc2、Vtc3和Vtc4,同源蛋白質(zhì)在其他低等生物中也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[30-31]。Vtc1是一個(gè)僅包含3次跨膜螺旋的小整合膜蛋白。Vtc2、Vtc3 和Vtc4 在序列上高度同源,在C 端與Vtc1 共享類似的跨膜結(jié)構(gòu)域,并具有在Pi穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用的N端SPX(Syg1/Pho81/XPR1)結(jié)構(gòu)域和隧道形狀的中心結(jié)構(gòu)域(圖1)。 酵母中Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域(Vtc4189-480)已經(jīng)被證實(shí)具有多聚磷酸鹽聚合酶活性,而Vtc2 或Vtc3 的中心結(jié)構(gòu)是無催化活性的[27]。最近還發(fā)現(xiàn)了VTC 復(fù)合體可能的第5 個(gè)亞基Vtc5[32],該亞基由具有和Vtc2、Vtc3和Vtc4相似的結(jié)構(gòu)域組成,但是序列相似性很低。Vtc5 對VTC 復(fù)合體的活性不是必需的,表明它是一個(gè)可選的調(diào)節(jié)亞基[32]。

        Fig. 1 Domain composition of VTC complex subunits圖1 VTC復(fù)合體亞基的結(jié)構(gòu)域組成

        Vtc4的中心結(jié)構(gòu)域(Vtc4189-480)的結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)隧道狀的催化合成口袋(圖2),而且重組表達(dá)的Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域具有聚合酶活性,能夠利用ATP合成polyP[27]。Vtc4中心結(jié)構(gòu)域的隧道狀口袋分布著眾多保守的堿性氨基酸(K200、R264、R266、K281、R361、K458)、絲氨酸(S457)和酪氨酸(Y359),這些氨基酸已經(jīng)被證實(shí)在polyP合成中發(fā)揮著重要作用。Vtc4189-480與Pi、PPi、底物類似物AppNHp (adenosine-5'-[(β,γ)-imido]triphosphate) 和polyP 的晶體結(jié)構(gòu)也已經(jīng)被獲得[27]。從Pi、PPi、AppNHp 到polyP,這些晶體結(jié)構(gòu)或許暗示著VTC復(fù)合體利用ATP合成polyP并將其轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。同時(shí),PPi能夠高度刺激Vtc4 催化結(jié)構(gòu)域的polyP合成活性,Pi和PPPi刺激效果較弱。因此,PPi可能提供啟動(dòng)合成polyP鏈的引物。Vtc4的催化結(jié)構(gòu)域?qū)TP 和dATP 具有相似的親和力,對CTP 和GTP 的親和力僅僅低5 倍。在晶體結(jié)構(gòu)中,核苷部分沒有結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)僅與底物三磷酸腺苷的三磷酸部分發(fā)生相互作用。polyP 結(jié)合在Vtc4的隧道內(nèi),該隧道由保守的堿性殘基組成,并包含活性位點(diǎn)。Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上與RNA 三磷酸酶Cet1 相似[27]。雖然這些晶體似乎暗示著polyP 合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的過程,但是由于缺乏完整VTC復(fù)合體的結(jié)構(gòu),難以確定生理狀態(tài)下的polyP合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

        Fig. 2 The crystal structure of the central domain of Vtc4 that combines different substrates and products圖2 Vtc4的中心結(jié)構(gòu)域與不同底物和產(chǎn)物的晶體結(jié)構(gòu)

        盡管VTC 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和中心結(jié)構(gòu)域序列在多細(xì)胞生物中并不保守,但是位于N端的SPX結(jié)構(gòu)域在植物、蒼蠅和哺乳動(dòng)物中都被發(fā)現(xiàn)。包含SPX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控Pi穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。Vtc4 SPX 結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)顯示包含6個(gè)α螺旋,其中2個(gè)小螺旋αI和αII形成N端螺旋發(fā)夾,以及由2 個(gè)長螺旋αIII 和αIV 以及C端2 個(gè)較小的螺旋αV 和αVI 形成的三螺旋束[28]。SPX結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)大的帶正電荷的表面,分布著眾多的賴氨酸殘基,這些賴氨酸殘基在不同物種含SPX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中是高度保守的(圖3)。

        Fig. 3 The structure of SPXScVtc4 reveals a conserved ligand binding surface圖3 SPXScVtc4的結(jié)構(gòu)揭示了保守的配體結(jié)合表面

        SPX 結(jié)構(gòu)域能夠與含磷酸鹽的配體相互作用,但對Pi本身表現(xiàn)出很小的特異性和選擇性。InsP6激酶Kcs1(其產(chǎn)生肌醇焦磷酸(PP-InsP)信號分子)的缺失消除了VTC 產(chǎn)生的polyP 儲(chǔ)存,PP-InsP 可能調(diào)控體內(nèi)polyP 的積累[33]。Gerasimaite 等[34]化學(xué)合成了5-InsP7,一種Kcs1 反應(yīng)產(chǎn)物,并發(fā)現(xiàn)它在濃度高于100 nmol/L 時(shí)能夠顯著刺激VTC 催化合成polyP。相反,Pi和SO42-僅在毫摩爾濃度下才能激活VTC 復(fù)合體,InsP5、InsP4或InsP3不能刺激VTC催化合成polyP[28]。后續(xù)體內(nèi)和體外證據(jù)都表明,5-InsP7是SPX 依賴性VTC 復(fù)合物的生理相關(guān)刺激因子。由于化學(xué)合成的5-InsP7含量很低,同時(shí)SPX結(jié)構(gòu)域?qū)?-InsP7和InsP6具有相似的親和力,因此InsP6可以當(dāng)做5-InsP7的商業(yè)化替代品用于后續(xù)功能和結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。SPX結(jié)構(gòu)域保守的堿性表面簇殘基突變降低了VTC復(fù)合體的polyP合成活性,相反發(fā)現(xiàn)唯一一對突變Vtc3K126A/Vtc4K129A顯著增強(qiáng)了VTC 復(fù)合體的polyP 合成活性[28]。研究還發(fā)現(xiàn),Vtc3K126A/Vtc4K129A雙突變也增加了酵母細(xì)胞內(nèi)polyP含量[34],這或許暗示雙突變的VTC 復(fù)合體可能處于激活狀態(tài)。

        VTC 復(fù)合體可能以兩種穩(wěn)定的亞復(fù)合體形式存在,Vtc4/Vtc2/Vtc1 復(fù)合體和Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體。熒光定位實(shí)驗(yàn)顯示:Vtc3 主要位于液泡膜上;Vtc2 的位置隨環(huán)境中Pi濃度變化而變化[27]。當(dāng)細(xì)胞處于Pi饑餓狀態(tài),Vtc2 主要定位在液泡膜上;當(dāng)細(xì)胞處于Pi豐富的環(huán)境中,Vtc2在細(xì)胞內(nèi)分布比較分散,分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細(xì)胞核膜、線粒體膜和細(xì)胞膜等[27]。細(xì)胞可能需要存在兩種不同的VTC亞復(fù)合體以創(chuàng)建具有不同調(diào)節(jié)的polyP池來響應(yīng)不同的應(yīng)急壓力。與此相一致,polyP 不僅被發(fā)現(xiàn)集中在酸鈣小體樣液泡中,在細(xì)胞核中也有一個(gè)獨(dú)特的polyP池,通過多聚磷酸化控制拓?fù)洚悩?gòu)酶1(Top1)的定位和活性[23]。

        近年來,關(guān)于VTC 復(fù)合體的研究取得了長足的進(jìn)步,但是幾個(gè)相關(guān)的基本問題仍然懸而未決。首先,生理狀態(tài)下的VTC 復(fù)合體是如何組裝的?雖然Vtc2 和Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)[27]以及Vtc4 SPX 結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)[28]陸續(xù)被獲得,然而這些結(jié)構(gòu)提供了有關(guān)VTC 復(fù)合體的化學(xué)計(jì)量比和組裝的有限信息。因此,獲得完整VTC 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)將有助于很好地理解VTC 復(fù)合體的組裝。其次,VTC復(fù)合體的功能完整性。VTC 復(fù)合體不僅是一種polyP 聚合酶,也是一種polyP 易位酶。為了避免polyP在細(xì)胞質(zhì)中積累的毒性,polyP合成和立即轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中是耦合的[29]。然而,這種耦合機(jī)制仍是不清楚的。最后,VTC復(fù)合體是如何調(diào)控polyP的合成?當(dāng)胞漿Pi濃度足夠高時(shí),VTC復(fù)合體應(yīng)合成polyP;而當(dāng)胞漿Pi濃度較低時(shí),VTC 復(fù)合體應(yīng)關(guān)閉polyP 的合成,以避免從胞漿中耗盡Pi。VTC復(fù)合體的活性受到肌醇磷酸信號分子的調(diào)節(jié),包括高度磷酸化、可擴(kuò)散的肌醇多磷酸鹽(InsPs)和肌醇焦磷酸鹽(PP-InsPs)[28,34]。但是,目前尚不清楚這種調(diào)控機(jī)制。最近發(fā)表的完整VTC 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)對以上科學(xué)問題提出了見解,下面將著重介紹。

        2 VTC復(fù)合體的結(jié)構(gòu)

        近年來,Vtc2和Vtc4中心結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)[27]以及Vtc4 SPX結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)[28]陸續(xù)被獲得,然而這些結(jié)構(gòu)提供了有關(guān)VTC 復(fù)合體的化學(xué)計(jì)量比和組裝的有限信息。最近,完整VTC 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)被發(fā)表,包括本實(shí)驗(yàn)室解析的處于非激活態(tài)(apo state)的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體[35]以及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉主課題組[36]解析的結(jié)合InsP6的激活態(tài)Vtc4R264A/R266A/E426N/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體。這兩篇文章都報(bào)道了Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)意想不到的異源五聚體,包含1 個(gè)Vtc4、1 個(gè)Vtc3和3個(gè)Vtc1亞基(圖4)。每個(gè)亞基的3次跨膜螺旋(TM1~3)以贗對稱的方式組裝,形成圓柱形五聚體跨膜結(jié)構(gòu)域。Vtc3 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和Vtc4 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域形成非對稱的異源二聚體??紤]到Vtc2 和Vtc3 在序列上是高度同源的,Vtc4/Vtc2/Vtc1復(fù)合體可能采取和Vtc4/Vtc3/Vtc1復(fù)合體相似的化學(xué)計(jì)量比和組裝方式。

        在本課題組的文章中,基于結(jié)構(gòu)分析和功能數(shù)據(jù),對polyP 的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)、polyP 通道的門控機(jī)制及VTC 復(fù)合體的激活機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)構(gòu)和體外polyP 合成實(shí)驗(yàn)都支持VTC 偶聯(lián)polyP 聚合酶和轉(zhuǎn)位酶活性。同時(shí),利用純化的液泡和5-InsP7以及1,5-InsP8等生理性配體對VTC 的功能展開了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),純化的VTC 復(fù)合體以ATP-和肌醇多聚磷酸鹽(PP-InsPs)依賴的方式合成polyP。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),只有Vtc4 的SPX 結(jié)構(gòu)域?qū)τ趐olyP 的合成和PP-InsPs 調(diào)控是至關(guān)重要的,而Vtc3 主要通過磷酸化的loop 來調(diào)控polyP 的合成。該結(jié)構(gòu)中,跨膜區(qū)形成一個(gè)polyP選擇性通道,可能采用靜息態(tài)構(gòu)象,其中Vtc4 的閂鎖狀水平螺旋(HH)限制了polyP的進(jìn)入。Vtc4的催化中心結(jié)構(gòu)域位于贗對稱polyP 通道的頂部,為新合成的polyP 創(chuàng)造了一個(gè)強(qiáng)正電性通路,該通路可以將合成與易位耦合。Vtc4 的水平螺旋以及亞基間多對保守的鹽橋形成的“離子鎖”有助于探究polyP通道的門控機(jī)制?;谝陨辖Y(jié)構(gòu)和功能信息,推測了一個(gè)簡化的VTC激活機(jī)制模型。

        Fig. 4 Structure of the intact VTC complex圖4 完整VTC復(fù)合體的結(jié)構(gòu)

        在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉主課題組的文章中,作者利用Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域的三突變(R264A/R266A/E426N)和PP-InsPs的商業(yè)化替代品InsP6解析了處于激活態(tài)的VTC的結(jié)構(gòu)。他們發(fā)現(xiàn),PP-InsP只是特異性結(jié)合在SPXVtc4,而非SPXVtc3,暗示只有SPXVtc4發(fā)揮感知PP-InsP 信號的功能。同樣地,作者也證實(shí)VTC偶聯(lián)polyP的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)。此外,作者運(yùn)用smFRET 技術(shù),在單分子水平研究了VTC感知PP-InsP 信號后結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn),PP-InsP 作為信號分子,它結(jié)合Vtc4,通過別構(gòu)調(diào)控,誘導(dǎo)VTC的構(gòu)象發(fā)生變化,使polyP的合成結(jié)構(gòu)域向跨膜通道靠近,VTC 從抑制態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顟B(tài),開啟polyP的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)。

        雖然這兩個(gè)結(jié)構(gòu)是高度相似的,但是也存在一些差異。首先,在apo state中,Vtc4中心結(jié)構(gòu)域的隧道狀口袋中包含三磷酸鹽-Mn2+,這可能與復(fù)合體的內(nèi)源性表達(dá)相關(guān),相反,在InsP6結(jié)合的激活態(tài)中,Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域的隧道狀口袋被一個(gè)InsP6分子占據(jù),這或許是因?yàn)? mmol/L 的InsP6并非生理濃度而導(dǎo)致的非特異性結(jié)合。除此之外,結(jié)構(gòu)中還包含另外2個(gè)InsP6分子,1個(gè)結(jié)合在Vtc4 SPX結(jié)構(gòu)域的肌醇多磷酸鹽(PP-InsPs)結(jié)合表面,另外1 個(gè)結(jié)合在Vtc3 和Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域之間,可能促進(jìn)了這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合(圖4)。其次,在靠近胞質(zhì)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)通道的入口處,在apo state中,Vtc4的一段水平螺旋(horizonal helix,HH)橫跨在入口,堵塞polyP的進(jìn)入,相反,在InsP6結(jié)合的激活態(tài)中,兩個(gè)磷酸鹽分子在通道入口處(圖4)。再次,在apo state 中,由Vtc1 的M42、Vtc3 的L716和Vtc4的L640 組成了轉(zhuǎn)運(yùn)通道的最窄點(diǎn),直徑僅有4 ?,小于polyP 的鮑林半徑(3 ?),不允許polyP 通過,而在InsP6結(jié)合的激活態(tài)中,Vtc1 的R31、Vtc3的R709和Vtc4的R629組成了轉(zhuǎn)運(yùn)通道的最窄點(diǎn),直徑僅有3 ?,同樣地不允許polyP 通過。最后,在apo state 中,內(nèi)源性表達(dá)的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體具有完全的polyP 合成活性,相反,在InsP6結(jié)合的激活態(tài)中,包含3 個(gè)突變的Vtc4R264A/R266A/E426N/Vtc3/Vtc1復(fù)合體的polyP合成活性被完全廢除。這兩個(gè)處于不同狀態(tài)的結(jié)構(gòu)展示了完整VTC 復(fù)合體的化學(xué)計(jì)量比和組裝方式,極大地推動(dòng)了后續(xù)VTC復(fù)合體的功能研究。

        3 VTC復(fù)合體的功能

        酵母中polyP 聚合酶是一種大型膜蛋白復(fù)合物,最初被命名為VTC[30]。在其polyP聚合酶的催化活性被確定之前,VTC 復(fù)合物被發(fā)現(xiàn)是V-ATP酶穩(wěn)定性和運(yùn)輸、酵母液泡膜融合和微自噬所必需的[31,37-38],但是目前并不清楚是polyP還是VTC復(fù)合物本身參與了這些過程。VTC 復(fù)合體作為唯一已知的真核生物polyP聚合酶,利用ATP在胞質(zhì)中合成polyP,并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中儲(chǔ)存,以維持細(xì)胞內(nèi)Pi穩(wěn)態(tài)。因此,VTC復(fù)合體具有polyP聚合酶和轉(zhuǎn)位酶的雙重功能。在細(xì)胞內(nèi),VTC 復(fù)合物的活性受到肌醇磷酸鹽信號分子的調(diào)節(jié),包括高度磷酸化、可擴(kuò)散的肌醇多磷酸鹽(InsPs)和肌醇焦磷酸鹽(PP-InsPs)[28,34]。具體研究詳述如下。

        3.1 VTC復(fù)合體偶聯(lián)polyP的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)

        VTC復(fù)合體不僅是一個(gè)polyP聚合酶,還是一個(gè)polyP 轉(zhuǎn)位酶。為了避免polyP 在胞質(zhì)中的積累對細(xì)胞造成的毒害作用,polyP 的合成和立即轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡是偶聯(lián)的[29,39]。最近獲得的兩個(gè)完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)都清晰地支持這種偶聯(lián)機(jī)制[35-36]。

        在完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)中,Vtc4的中心結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域是共價(jià)連接的(圖5)。Vtc4作為催化亞基,負(fù)責(zé)polyP的合成,Vtc4敲除顯著降低細(xì)胞內(nèi)polyP含量[40]。Vtc4中心結(jié)構(gòu)域的隧道狀口袋分布著眾多保守的堿性氨基酸(K200、R264、 R266、 K281、 R361、 K458)、 絲 氨 酸(S457)和酪氨酸(Y359),這些氨基酸已經(jīng)被證實(shí)在polyP合成中發(fā)揮著重要作用[27,35]。一段由眾多堿性氨基酸(R196、 R253、 K256、 K291、K294、R373、K428、K455、R618)組成的蜿蜒曲折通道連接了Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)和跨膜通道入口,暗示新生的polyP可能從此通道行進(jìn)到跨膜孔,從而完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。這一結(jié)構(gòu)信息為polyP 合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制提供了理論支持。同時(shí),這些堿性氨基酸突變成酸性氨基酸也已經(jīng)被證實(shí)能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)polyP的含量[35]。

        Fig. 5 The structure of the Vtc4 /Vtc3 /Vtc1 complex supports a coupled mechanism of polyP synthesis and transport圖5 Vtc4/Vtc3/Vtc1復(fù)合體的結(jié)構(gòu)支持polyP合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制

        Vtc4、Vtc3和3個(gè)Vtc1的跨膜螺旋以贗對稱的方式排列成異源五聚體。每個(gè)亞基的TM1 螺旋形成圓柱體的內(nèi)環(huán)作為polyP轉(zhuǎn)運(yùn)的核心通道,每個(gè)亞基的TM2 和TM3 螺旋形成圓柱體的外環(huán)包裹著內(nèi)環(huán)。在apo state 和InsP6-activated state 結(jié)構(gòu)中,由于最窄點(diǎn)直徑都小于polyP直徑,因此,跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道都不允許polyP通過。同時(shí)也發(fā)現(xiàn),在靠近胞質(zhì)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)通道的入口處,在apo state中,Vtc4的一段HH 橫跨在入口,堵塞polyP 的進(jìn)入,相反,在InsP6結(jié)合的激活態(tài)中,2個(gè)磷酸鹽分子在通道入口處(圖4)。由于2個(gè)結(jié)構(gòu)被捕獲在不同的功能狀態(tài),因此結(jié)構(gòu)差異也是合理的。

        生化實(shí)驗(yàn)也顯示,單獨(dú)表達(dá)的Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出很低的polyP合成活性,而完整的VTC復(fù)合體在體內(nèi)具有很高的活性[27,29],而且相比于去垢劑溶解的VTC 復(fù)合體,攜帶VTC 復(fù)合體的液泡表現(xiàn)出超過100 倍的polyP 合成活性[29],這表明VTC 復(fù)合體的完全催化活性需要一個(gè)完整的膜環(huán)境。因此,提出polyP合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制也是合理的,其中來自跨膜區(qū)域的驅(qū)動(dòng)力將新生的polyP 鏈拉入跨膜通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),從而將帶負(fù)電的聚合物從帶正電的催化中心排出,并允許添加新的磷酸鹽殘基。

        3.2 肌醇多磷酸鹽(PP-InsPs)調(diào)控polyP的合成

        VTC復(fù)合體精確調(diào)控polyP的合成對于維持細(xì)胞內(nèi)Pi穩(wěn)態(tài)是必需的。包含SPX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控Pi穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[41]。單獨(dú)表達(dá)的SPX 結(jié)構(gòu)域能夠與含磷酸鹽的配體發(fā)生相互作用,但對Pi本身表現(xiàn)出很小的特異性和選擇性[28]。PP-InsPs 也被發(fā)現(xiàn)在控制酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞磷酸鹽穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[42-43]。VTC復(fù)合體的polyP合成活性在體內(nèi)收到肌醇焦磷酸鹽(5-InsP7和1,5-InsP8等)的調(diào)控[28],同時(shí)肌醇磷酸鹽(InsP6)也被發(fā)現(xiàn)在體外能夠刺激VTC 復(fù)合體合成polyP[28,35-36]。

        SPX結(jié)構(gòu)域存在于所有真核生物中,并具有共同的序列和結(jié)構(gòu)特征,保守的賴氨酸殘基形成肌醇多磷酸鹽和焦磷酸鹽的高親和力(亞微摩爾)結(jié)合位點(diǎn)[28]。純化的SPX 結(jié)構(gòu)域在結(jié)合不同的肌醇多磷酸鹽或焦磷酸鹽異構(gòu)體方面表現(xiàn)出相對較低的選擇性,并且它們的親和力隨化合物的凈電荷降低而降低(InsP8>InsP7>InsP6)[34]。與低選擇性形成鮮明對比的是,不同異構(gòu)體的激動(dòng)劑性質(zhì)差異很大。例如,VTC復(fù)合體被1,5-InsP8強(qiáng)烈激活,但被攜帶相同數(shù)量磷酸基團(tuán)的5-PPP-InsP5激活效果非常弱[34]。同樣地,5-InsP7激活VTC,而InsP6幾乎沒有作用[34]。因此,盡管肌醇多磷酸鹽具有極高的電荷密度及其類似的結(jié)合親和力,SPX結(jié)構(gòu)域必須解碼配體的精確結(jié)構(gòu)特征,并將其轉(zhuǎn)化為不同程度的活性。

        釀酒酵母的基因組包含10 個(gè)編碼SPX 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),其中8種蛋白質(zhì)具有與Pi代謝相關(guān)的功能。它們分別是:2 個(gè)低親和力Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)Pho87 和Pho90 定位在細(xì)胞膜上[13,44];Pho91 位于液泡膜上并參與將Pi從液泡輸出到細(xì)胞質(zhì)[14];細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑Pho81[45];甘油磷酸膽堿磷酸二酯酶1(Gde1),可水解甘油磷酸膽堿,從而釋放膽堿和甘油3-磷酸,可作為Pi來源[46];酵母gpa1 抑制劑(Syg1)[47]和Ydr089(最近被鑒定為Vtc5)[32];多聚磷酸鹽聚合酶VTC復(fù)合體的3個(gè) 亞 基Vtc2、Vtc3 和Vtc4[48]。除 了Syg1 和Ydr089 之外,所有含有SPX 結(jié)構(gòu)域的酵母蛋白都被證明是維持酵母中Pi穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

        Vtc3和Vtc4 SPX結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)是高度相似的,135個(gè)Cα原子的均方根偏差為1.7 ?。相比于Vtc4,Vtc3 的SPX 結(jié)構(gòu)域在C 端還包含1 個(gè)額外的螺旋αVII,與αIV 和αVI 螺旋形成疏水相互作用(圖6)。兩個(gè)SPX 結(jié)構(gòu)域都具有由螺旋αII 和αIV 上的多個(gè)保守賴氨酸殘基形成的帶正電荷的表面(圖6),并且可以與含磷酸鹽的配體相互作用,在之前的研究中猜測兩者都是PP-InsPs 的受體[28]。最新的研究發(fā)現(xiàn),不論是對SPX 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行截?cái)啵?5],還是對SPX 結(jié)構(gòu)域上的保守賴氨酸殘基突變[36],攜帶突變體的VTC復(fù)合體體外polyP合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明,只有Vtc4 的SPX 結(jié)構(gòu)域能夠作為PP-InsPs感受器,響應(yīng)polyP合成和PP-InsPs調(diào)節(jié)。與此相一致,在InsP6-activated state 結(jié)構(gòu)中,InsP6只結(jié)合在Vtc4 的SPX 結(jié)構(gòu)域上(InsP6A)[36]。同時(shí),在Vtc3 和Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域之間也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)InsP6B,可能促進(jìn)了這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合[36]。

        除此之外,研究人員還發(fā)現(xiàn),Vtc3 通過磷酸化的loop 調(diào)控polyP 的合成[35]。在Vtc3 的非催化中心結(jié)構(gòu)域中存在一段不同尋常的loop(殘基234~292),在該loop 的C 端包含一簇磷酸化位點(diǎn)。研究人員通過取代6 個(gè)絲氨酸殘基(S263、S265、S267、S269、S270、S274)為丙氨酸或天冬氨酸來模擬該loop 的非磷酸化和磷酸化狀態(tài),證實(shí)該loop 的磷酸化對polyP 的合成具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。結(jié)合PP-InsPs 對VTC 復(fù)合體的調(diào)控作用,該loop 可以增強(qiáng)VTC調(diào)節(jié)polyP合成活性的動(dòng)態(tài)范圍,支持在Pi缺乏的情況下完全停止polyP 合成,同時(shí)在Pi充足時(shí)保持完全激活的潛力。

        Fig. 6 Structure of the SPX domain of the VTC complex圖6 VTC復(fù)合體的SPX結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征

        3.3 VTC復(fù)合體的激活機(jī)制

        完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)意想不到的異源五聚體組裝,包含1 個(gè)Vtc4、1 個(gè)Vtc3 和3 個(gè)Vtc1 亞基。Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域與跨膜區(qū)的連接以及二者之間形成的轉(zhuǎn)運(yùn)通道結(jié)構(gòu)清晰地支持polyP合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制。Vtc4的SPX結(jié)構(gòu)域作為PP-InsPs 感受器,響應(yīng)polyP 合成和PP-InsPs 調(diào)節(jié)。Vtc3 通過磷酸化的loop 調(diào)控polyP的合成?;谶@兩個(gè)處于不同功能狀態(tài)的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能信息,允許大家合理地推測一個(gè)VTC復(fù)合體的激活機(jī)制。

        在apo state結(jié)構(gòu)中,研究人員提出了一種可能的polyP通道門控機(jī)制[35]。首先,作者發(fā)現(xiàn)由TM1螺旋組成的polyP 通道的五重對稱性被破壞。同時(shí),觀察到形成界面的2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域具有不同的相對位置,其中Vtc1(β)-Vtc1(γ)和Vtc3-Vtc4緊密堆積,Vtc1(γ)-Vtc3松散堆積,Vtc1(α)-Vtc1(β)和Vtc4-Vtc1(α)介于二者之間。相應(yīng)地,Vtc3-Vtc4掩埋了最多的蛋白質(zhì)表面積(4 150 ?2),接下來分別是Vtc1(β)-Vtc1(γ) (2 920 ?2)、Vtc4-Vtc1(α)(2 870 ?2)和Vtc1(α)-Vtc1(β) (2 660 ?2)。Vtc1(γ)- Vtc3 相互作用界面掩埋了最少的蛋白質(zhì)表面積(2 350 ?2),這一數(shù)據(jù)也與觀察到的VTC 通道不對稱性相一致。有趣的是,在以疏水相互作用為主的亞基相互作用界面中心發(fā)現(xiàn)了幾對特殊的鹽橋,將其命名為亞基間“離子鎖”。其中Vtc1 的E30 和R83、Vtc3 的E704 和R762,以 及Vtc4 的E628 和R681 都是非常保守的(圖7a)?;诖?,作者假設(shè)polyP通道在靜息狀態(tài)下被捕獲,入口由Vtc4 的閂鎖狀水平螺旋固定。Vtc4 的水平螺旋在通道入口處的不對稱排列對polyP通道施加了不對稱的力,導(dǎo)致亞基間相互作用界面的相對位置不同。3 個(gè)松散堆積的亞基間相互作用界面,加上2個(gè)緊密堆積的亞基間相互作用界面,使得由TM1螺旋形成的通道直徑從胞質(zhì)側(cè)向液泡內(nèi)側(cè)逐漸變窄,形成一個(gè)可能用作門控的最窄點(diǎn)。亞基間的“離子鎖”可以將各亞基維持在一起。然而,在polyP 通道打開期間,水平螺旋閂鎖被抬起,VTC復(fù)合體的各亞基被“離子鎖”拉在一起,可能導(dǎo)致亞基之間形成所有的5個(gè)“離子鎖“。在這種狀態(tài)下,TM1 螺旋可能在胞質(zhì)側(cè)向內(nèi)傾斜,在液泡側(cè)向外傾斜,從而打開通道(圖7b)。

        相反,在InsP6-activated state 結(jié)構(gòu)中,作者認(rèn)為PP-InsPs 的結(jié)合使得Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域向跨膜通道入口靠近,從而偶聯(lián)polyP 的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)[36]。作者認(rèn)為Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域的取向主要由Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域間的連接以及與Vtc1(α)的N端(殘基1~21)之間相互作用來維持。其中Vtc1(α) N端的敲除會(huì)降低VTC復(fù)合體的催化活性,完全廢除液泡polyP的產(chǎn)生。為了闡明Vtc1的N端缺失是否會(huì)導(dǎo)致Vtc4 催化結(jié)構(gòu)域的運(yùn)動(dòng),作者進(jìn)行了單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)分析,這是一種單分子水平表征蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)和構(gòu)象變化的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,InsP6的結(jié)合使得Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域靠近跨膜結(jié)構(gòu)域,遠(yuǎn)離跨膜結(jié)構(gòu)域。而且,Vtc1 的N 端缺失會(huì)導(dǎo)致VTC 復(fù)合體不再被InsP6激活。

        基于處于不同功能狀態(tài)的2 種Vtc4/Vtc3/Vtc1復(fù)合體的結(jié)構(gòu),本課題組推測了一個(gè)可能的VTC復(fù)合體的激活機(jī)制(圖7c)。我們認(rèn)為VTC復(fù)合體包含1個(gè)polyP聚合酶和1個(gè)polyP通道,并在非活性狀態(tài)和活性狀態(tài)之間平衡存在。在非活性狀態(tài),Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)離跨膜通道,polyP 合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制被破壞,具有很低的聚合酶活性,同時(shí)Vtc4 的水平螺旋HH 堵塞在通道入口使得polyP轉(zhuǎn)運(yùn)通道處于關(guān)閉狀態(tài);在肌醇磷酸等信號分子的刺激下,Vtc4的中心結(jié)構(gòu)域在Vtc1(α) N端的幫助下靠近polyP 轉(zhuǎn)運(yùn)通道,完成polyP 合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián),同時(shí),Vtc4的水平螺旋HH遠(yuǎn)離通道入口使得polyP轉(zhuǎn)運(yùn)通道處于開放狀態(tài),VTC復(fù)合體從非活性狀態(tài)快速轉(zhuǎn)變成活性狀態(tài),高效催化ATP 合成polyP。

        Fig. 7 Activation mechanisms of the VTC complex圖7 VTC復(fù)合體的激活機(jī)制

        進(jìn)一步,之前的研究也報(bào)道了液泡polyP 的合成需要一個(gè)跨膜電化學(xué)勢能,可能由位于液泡上的V-ATPase 提供[29,49]。在體內(nèi),通過添加V-ATPase的抑制劑可以抑制液泡polyP 的合成;同時(shí),V-ATPase 亞基Vph1 的敲除會(huì)使得酵母細(xì)胞內(nèi)polyP含量降低20%(相比野生型)[29]?;趐olyP合成缺陷突變體的高通量篩選已經(jīng)識(shí)別了超過250種相關(guān)基因,其中也包括V-ATPase 的幾個(gè)亞基[50]。因此,跨膜區(qū)內(nèi)外的質(zhì)子梯度及其對細(xì)胞應(yīng)激的變化或許將調(diào)節(jié)VTC 的活性,如通道本身的構(gòu)象變化,從而刺激polyP的合成和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

        4 總結(jié)與展望

        釀酒酵母VTC復(fù)合體作為已知的真核polyP合成酶,通過偶聯(lián)polyP的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程來維持細(xì)胞內(nèi)Pi穩(wěn)態(tài)。近十年來,隨著VTC 復(fù)合體的相關(guān)研究逐漸增多,其結(jié)構(gòu)信息和作用機(jī)制也越來越清晰。最近發(fā)表的完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)極大地推動(dòng)了對VTC 復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能的理解。完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)異源五聚體組裝,結(jié)構(gòu)和功能信息都支持polyP合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制。Vtc4的SPX結(jié)構(gòu)域作為PP-InsPs感受器,響應(yīng)polyP 合成和PP-InsPs 調(diào)節(jié),同時(shí)Vtc3 通過磷酸化的loop 調(diào)控polyP 的合成?;赩tc2 和Vtc3 在序列上的高度同源,Vtc4/Vtc2/Vtc1復(fù)合體可能采取和Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體相似的化學(xué)計(jì)量比和組裝方式。目前還不清楚酵母細(xì)胞內(nèi)為什么存在兩種VTC復(fù)合體。相比Vtc4/Vtc3/Vtc1復(fù)合體只定位在液泡膜上,Vtc4/Vtc2/Vtc1 復(fù)合體在酵母細(xì)胞的定位隨環(huán)境中Pi的濃度而發(fā)生變化,這種廣泛的分布(細(xì)胞核膜、線粒體膜、細(xì)胞膜和液泡膜等)或許暗示Vtc4/Vtc2/Vtc1 復(fù)合體不僅具有polyP 聚合酶和轉(zhuǎn)位酶活性,或許還參與細(xì)胞內(nèi)其他生物學(xué)功能。因此,解析Vtc4/Vtc2/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)對于理解VTC 復(fù)合體的作用機(jī)制也是十分有幫助的。最近,雖然發(fā)表了處于兩種不同功能狀態(tài)的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體結(jié)構(gòu),但是二者結(jié)構(gòu)的高度相似性或許暗示VTC 復(fù)合體的激活可能不需要大的構(gòu)象轉(zhuǎn)變,目前的結(jié)構(gòu)信息還不足以闡明VTC 復(fù)合體的分子作用機(jī)制。因此,未來獲得其他功能狀態(tài)的結(jié)構(gòu)(包括polyP催化合成的不同階段以及轉(zhuǎn)運(yùn)通道完全開放狀態(tài)的結(jié)構(gòu)等)對于理解VTC復(fù)合體的分子作用機(jī)制是十分重要的。

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