劉 偉 葉 升

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

磷在生命活動(dòng)中扮演核心角色，它是生物遺傳物質(zhì)核酸和細(xì)胞膜磷脂的重要組成成分，是生物細(xì)胞能量代謝的載體物質(zhì)三磷酸腺苷（ATP）的結(jié)構(gòu)元素，還是動(dòng)物骨骼和牙齒的主要成分。自然界中大多數(shù)磷以不溶性的無機(jī)磷存在于礦物、土壤、巖石中，只有少量的可溶性磷，主要以無機(jī)磷酸鹽（Pi）的形式為生命所利用。細(xì)胞對(duì)磷酸鹽的需求隨著細(xì)胞生理情況的變化而變化，在細(xì)胞分裂間期的S 期因DNA 復(fù)制而達(dá)到峰值。然而磷酸鹽是所有核苷酸降解反應(yīng)的產(chǎn)物，細(xì)胞質(zhì)中過量的磷酸鹽會(huì)改變核苷酸降解反應(yīng)的平衡，降低反應(yīng)的自由能，從而影響相關(guān)的細(xì)胞生理。細(xì)胞質(zhì)磷酸鹽供應(yīng)不足會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，而磷酸鹽過量則會(huì)抑制細(xì)胞生理活動(dòng)從而對(duì)細(xì)胞造成傷害。因此，細(xì)胞需要維持細(xì)胞質(zhì)中磷酸鹽的穩(wěn)態(tài)，在滿足自身對(duì)磷酸鹽需求的同時(shí)防止細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生過多的磷酸鹽對(duì)細(xì)胞造成傷害。磷酸鹽穩(wěn)態(tài)在所有生物體中都是一個(gè)受嚴(yán)格調(diào)控的過程，其功能障礙會(huì)導(dǎo)致人類腎范科尼綜合征（Fanconi syndrome）［1］、植物生長(zhǎng)遲緩［2-3］和微生物致死［4］等多種功能紊亂。

生物體從多個(gè)層次維持機(jī)體的磷酸鹽穩(wěn)態(tài)。在機(jī)體層面，多細(xì)胞生物（如人類）可以通過腎臟的過濾和重吸收維持體液循環(huán)中的Pi濃度［5-6］。他們可以獲取骨骼中的磷灰石作為巨大的Pi儲(chǔ)備。同時(shí)，人類組織在質(zhì)膜中廣泛表達(dá)受調(diào)節(jié)的Pi輸出者（XPR1）［7］，這表明它們也可能保持對(duì)胞漿Pi峰值的保護(hù)。有趣的是，XPR1 也被發(fā)現(xiàn)與Pi在腎臟腎小管的重吸收有關(guān)［1］。對(duì)于植物來說，植物生長(zhǎng)需要大量的Pi，但大多數(shù)土壤中的Pi水平是有限的，并且不斷變化［8］。為了在自然界中生存克服這種Pi營養(yǎng)“脅迫”，植物不僅進(jìn)化出了強(qiáng)大的Pi吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，還進(jìn)化出了復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制［9］，將多余的Pi儲(chǔ)存在液泡中，以應(yīng)對(duì)土壤Pi的變化狀態(tài)。事實(shí)上，大部分（>90%）游離的Pi儲(chǔ)存在植物細(xì)胞的典型液泡中［10］。在單細(xì)胞生物如釀酒酵母中，Pi的感知、獲取和儲(chǔ)存主要由磷酸響應(yīng)信號(hào)通路（稱為PHO 通路）介導(dǎo)［11］。在Pi缺乏的情況下，PHO 操縱子被觸發(fā)，該操縱子控制一組旨在提高Pi攝入和Pi利用的基因。在釀酒酵母中，Pi獲取系統(tǒng)由4個(gè)定位在細(xì)胞膜的Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組成，其中2個(gè)低親和力Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，即Pho87、Pho90普遍表達(dá)［12］，而2 種高親和力Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pho84 和Pho89 由PHO 途徑調(diào)節(jié)［13］。最初被認(rèn)為是低親和力Pi攝取系統(tǒng)的Pho91 最近被證明位于液泡膜上，并參與將Pi從液泡輸出到細(xì)胞質(zhì)［14］。有趣的是，Pho87、Pho90 和Pho91 都具有SPX 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通常存在于參與調(diào)節(jié)Pi穩(wěn)態(tài)的蛋白質(zhì)中［15］。

為了在Pi的生物合成需求和胞質(zhì)Pi濃度過高的風(fēng)險(xiǎn)之間實(shí)現(xiàn)微妙的平衡，細(xì)胞以無機(jī)多聚磷酸鹽（polyP）的形式將Pi儲(chǔ)存在膜結(jié)合的酸鈣小體樣細(xì)胞器中［16］。酸鈣小體是從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物都保守的一類膜結(jié)合細(xì)胞器，但其功能尚不清楚。酵母細(xì)胞有一個(gè)類似的酸鈣小體樣細(xì)胞器，即液泡，它攜帶所有集中在酸鈣小體中化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［17］。polyP 是由數(shù)十至數(shù)百個(gè)正磷酸鹽殘基通過高能磷酸酐鍵連接而成，存在于所有生物中。polyP 參與真核生物中的許多過程，包括激活炎癥反應(yīng)［18-19］、促進(jìn)血液凝固［20］、促進(jìn)軟骨的發(fā)育和再生［21］、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［22］、蛋白質(zhì)多聚磷酸化修飾［23］以及調(diào)節(jié)離子通道活性［24］等。polyP 儲(chǔ)存在酸性鈣小體管腔中，同時(shí)多磷酸酶（Ppn1/Ppn2）也位于該管腔中。假設(shè)這些酶可以水解polyP，這可能允許釋放的Pi再輸出進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［25-26］。因此，酸鈣小體樣細(xì)胞器可能是胞漿Pi的重要緩沖裝置。

釀酒酵母液泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白伴侶（vacuolar transporter chaperone，VTC）復(fù)合體作為已知的真核生物多聚磷酸鹽聚合酶，利用ATP在胞質(zhì)中合成polyP，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中儲(chǔ)存起來以維持細(xì)胞內(nèi)Pi穩(wěn)態(tài)。近年來，隨著VTC 復(fù)合體的聚合酶和轉(zhuǎn)位酶功能被鑒定［27-28］，polyP 合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制也被確定［29］。雖然目前已經(jīng)獲得了一些結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)［27-28］，但是有限的信息限制了生理狀態(tài)下VTC 復(fù)合體的組裝、調(diào)控以及激活機(jī)制的研究。最近發(fā)表的完整VTC 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)極大地推動(dòng)了對(duì)VTC復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能的理解。

1 VTC復(fù)合體的研究現(xiàn)狀

釀酒酵母VTC 復(fù)合體包含了至少4 個(gè)亞基：Vtc1、Vtc2、Vtc3和Vtc4，同源蛋白質(zhì)在其他低等生物中也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)［30-31］。Vtc1是一個(gè)僅包含3次跨膜螺旋的小整合膜蛋白。Vtc2、Vtc3 和Vtc4 在序列上高度同源，在C 端與Vtc1 共享類似的跨膜結(jié)構(gòu)域，并具有在Pi穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用的N端SPX（Syg1/Pho81/XPR1）結(jié)構(gòu)域和隧道形狀的中心結(jié)構(gòu)域（圖1）。 酵母中Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域（Vtc4189-480）已經(jīng)被證實(shí)具有多聚磷酸鹽聚合酶活性，而Vtc2 或Vtc3 的中心結(jié)構(gòu)是無催化活性的［27］。最近還發(fā)現(xiàn)了VTC 復(fù)合體可能的第5 個(gè)亞基Vtc5［32］，該亞基由具有和Vtc2、Vtc3和Vtc4相似的結(jié)構(gòu)域組成，但是序列相似性很低。Vtc5 對(duì)VTC 復(fù)合體的活性不是必需的，表明它是一個(gè)可選的調(diào)節(jié)亞基［32］。

Fig. 1 Domain composition of VTC complex subunits圖1 VTC復(fù)合體亞基的結(jié)構(gòu)域組成

Vtc4的中心結(jié)構(gòu)域（Vtc4189-480）的結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)隧道狀的催化合成口袋（圖2），而且重組表達(dá)的Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域具有聚合酶活性，能夠利用ATP合成polyP［27］。Vtc4中心結(jié)構(gòu)域的隧道狀口袋分布著眾多保守的堿性氨基酸（K200、R264、R266、K281、R361、K458）、絲氨酸（S457）和酪氨酸（Y359），這些氨基酸已經(jīng)被證實(shí)在polyP合成中發(fā)揮著重要作用。Vtc4189-480與Pi、PPi、底物類似物AppNHp （adenosine-5'-[(β,γ)-imido]triphosphate） 和polyP 的晶體結(jié)構(gòu)也已經(jīng)被獲得［27］。從Pi、PPi、AppNHp 到polyP，這些晶體結(jié)構(gòu)或許暗示著VTC復(fù)合體利用ATP合成polyP并將其轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。同時(shí)，PPi能夠高度刺激Vtc4 催化結(jié)構(gòu)域的polyP合成活性，Pi和PPPi刺激效果較弱。因此，PPi可能提供啟動(dòng)合成polyP鏈的引物。Vtc4的催化結(jié)構(gòu)域?qū)TP 和dATP 具有相似的親和力，對(duì)CTP 和GTP 的親和力僅僅低5 倍。在晶體結(jié)構(gòu)中，核苷部分沒有結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)僅與底物三磷酸腺苷的三磷酸部分發(fā)生相互作用。polyP 結(jié)合在Vtc4的隧道內(nèi)，該隧道由保守的堿性殘基組成，并包含活性位點(diǎn)。Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上與RNA 三磷酸酶Cet1 相似［27］。雖然這些晶體似乎暗示著polyP 合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，但是由于缺乏完整VTC復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，難以確定生理狀態(tài)下的polyP合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

Fig. 2 The crystal structure of the central domain of Vtc4 that combines different substrates and products圖2 Vtc4的中心結(jié)構(gòu)域與不同底物和產(chǎn)物的晶體結(jié)構(gòu)

盡管VTC 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和中心結(jié)構(gòu)域序列在多細(xì)胞生物中并不保守，但是位于N端的SPX結(jié)構(gòu)域在植物、蒼蠅和哺乳動(dòng)物中都被發(fā)現(xiàn)。包含SPX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控Pi穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。Vtc4 SPX 結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)顯示包含6個(gè)α螺旋，其中2個(gè)小螺旋αI和αII形成N端螺旋發(fā)夾，以及由2 個(gè)長(zhǎng)螺旋αIII 和αIV 以及C端2 個(gè)較小的螺旋αV 和αVI 形成的三螺旋束［28］。SPX結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)大的帶正電荷的表面，分布著眾多的賴氨酸殘基，這些賴氨酸殘基在不同物種含SPX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中是高度保守的（圖3）。

Fig. 3 The structure of SPXScVtc4 reveals a conserved ligand binding surface圖3 SPXScVtc4的結(jié)構(gòu)揭示了保守的配體結(jié)合表面

SPX 結(jié)構(gòu)域能夠與含磷酸鹽的配體相互作用，但對(duì)Pi本身表現(xiàn)出很小的特異性和選擇性。InsP6激酶Kcs1（其產(chǎn)生肌醇焦磷酸（PP-InsP）信號(hào)分子）的缺失消除了VTC 產(chǎn)生的polyP 儲(chǔ)存，PP-InsP 可能調(diào)控體內(nèi)polyP 的積累［33］。Gerasimaite 等［34］化學(xué)合成了5-InsP7，一種Kcs1 反應(yīng)產(chǎn)物，并發(fā)現(xiàn)它在濃度高于100 nmol/L 時(shí)能夠顯著刺激VTC 催化合成polyP。相反，Pi和SO42-僅在毫摩爾濃度下才能激活VTC 復(fù)合體，InsP5、InsP4或InsP3不能刺激VTC催化合成polyP［28］。后續(xù)體內(nèi)和體外證據(jù)都表明，5-InsP7是SPX 依賴性VTC 復(fù)合物的生理相關(guān)刺激因子。由于化學(xué)合成的5-InsP7含量很低，同時(shí)SPX結(jié)構(gòu)域?qū)?-InsP7和InsP6具有相似的親和力，因此InsP6可以當(dāng)做5-InsP7的商業(yè)化替代品用于后續(xù)功能和結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。SPX結(jié)構(gòu)域保守的堿性表面簇殘基突變降低了VTC復(fù)合體的polyP合成活性，相反發(fā)現(xiàn)唯一一對(duì)突變Vtc3K126A/Vtc4K129A顯著增強(qiáng)了VTC 復(fù)合體的polyP 合成活性［28］。研究還發(fā)現(xiàn)，Vtc3K126A/Vtc4K129A雙突變也增加了酵母細(xì)胞內(nèi)polyP含量［34］，這或許暗示雙突變的VTC 復(fù)合體可能處于激活狀態(tài)。

VTC 復(fù)合體可能以兩種穩(wěn)定的亞復(fù)合體形式存在，Vtc4/Vtc2/Vtc1 復(fù)合體和Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體。熒光定位實(shí)驗(yàn)顯示：Vtc3 主要位于液泡膜上；Vtc2 的位置隨環(huán)境中Pi濃度變化而變化［27］。當(dāng)細(xì)胞處于Pi饑餓狀態(tài)，Vtc2 主要定位在液泡膜上；當(dāng)細(xì)胞處于Pi豐富的環(huán)境中，Vtc2在細(xì)胞內(nèi)分布比較分散，分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細(xì)胞核膜、線粒體膜和細(xì)胞膜等［27］。細(xì)胞可能需要存在兩種不同的VTC亞復(fù)合體以創(chuàng)建具有不同調(diào)節(jié)的polyP池來響應(yīng)不同的應(yīng)急壓力。與此相一致，polyP 不僅被發(fā)現(xiàn)集中在酸鈣小體樣液泡中，在細(xì)胞核中也有一個(gè)獨(dú)特的polyP池，通過多聚磷酸化控制拓?fù)洚悩?gòu)酶1（Top1）的定位和活性［23］。

近年來，關(guān)于VTC 復(fù)合體的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是幾個(gè)相關(guān)的基本問題仍然懸而未決。首先，生理狀態(tài)下的VTC 復(fù)合體是如何組裝的？雖然Vtc2 和Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)［27］以及Vtc4 SPX 結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)［28］陸續(xù)被獲得，然而這些結(jié)構(gòu)提供了有關(guān)VTC 復(fù)合體的化學(xué)計(jì)量比和組裝的有限信息。因此，獲得完整VTC 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)將有助于很好地理解VTC 復(fù)合體的組裝。其次，VTC復(fù)合體的功能完整性。VTC 復(fù)合體不僅是一種polyP 聚合酶，也是一種polyP 易位酶。為了避免polyP在細(xì)胞質(zhì)中積累的毒性，polyP合成和立即轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中是耦合的［29］。然而，這種耦合機(jī)制仍是不清楚的。最后，VTC復(fù)合體是如何調(diào)控polyP的合成？當(dāng)胞漿Pi濃度足夠高時(shí)，VTC復(fù)合體應(yīng)合成polyP；而當(dāng)胞漿Pi濃度較低時(shí)，VTC 復(fù)合體應(yīng)關(guān)閉polyP 的合成，以避免從胞漿中耗盡Pi。VTC復(fù)合體的活性受到肌醇磷酸信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，包括高度磷酸化、可擴(kuò)散的肌醇多磷酸鹽（InsPs）和肌醇焦磷酸鹽（PP-InsPs）［28，34］。但是，目前尚不清楚這種調(diào)控機(jī)制。最近發(fā)表的完整VTC 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)對(duì)以上科學(xué)問題提出了見解，下面將著重介紹。

2 VTC復(fù)合體的結(jié)構(gòu)

近年來，Vtc2和Vtc4中心結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)［27］以及Vtc4 SPX結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)［28］陸續(xù)被獲得，然而這些結(jié)構(gòu)提供了有關(guān)VTC 復(fù)合體的化學(xué)計(jì)量比和組裝的有限信息。最近，完整VTC 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)被發(fā)表，包括本實(shí)驗(yàn)室解析的處于非激活態(tài)（apo state）的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體［35］以及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉主課題組［36］解析的結(jié)合InsP6的激活態(tài)Vtc4R264A/R266A/E426N/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體。這兩篇文章都報(bào)道了Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)意想不到的異源五聚體，包含1 個(gè)Vtc4、1 個(gè)Vtc3和3個(gè)Vtc1亞基（圖4）。每個(gè)亞基的3次跨膜螺旋（TM1~3）以贗對(duì)稱的方式組裝，形成圓柱形五聚體跨膜結(jié)構(gòu)域。Vtc3 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和Vtc4 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域形成非對(duì)稱的異源二聚體?？紤]到Vtc2 和Vtc3 在序列上是高度同源的，Vtc4/Vtc2/Vtc1復(fù)合體可能采取和Vtc4/Vtc3/Vtc1復(fù)合體相似的化學(xué)計(jì)量比和組裝方式。

在本課題組的文章中，基于結(jié)構(gòu)分析和功能數(shù)據(jù)，對(duì)polyP 的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)、polyP 通道的門控機(jī)制及VTC 復(fù)合體的激活機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)構(gòu)和體外polyP 合成實(shí)驗(yàn)都支持VTC 偶聯(lián)polyP 聚合酶和轉(zhuǎn)位酶活性。同時(shí)，利用純化的液泡和5-InsP7以及1,5-InsP8等生理性配體對(duì)VTC 的功能展開了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化的VTC 復(fù)合體以ATP-和肌醇多聚磷酸鹽（PP-InsPs）依賴的方式合成polyP。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，只有Vtc4 的SPX 結(jié)構(gòu)域?qū)τ趐olyP 的合成和PP-InsPs 調(diào)控是至關(guān)重要的，而Vtc3 主要通過磷酸化的loop 來調(diào)控polyP 的合成。該結(jié)構(gòu)中，跨膜區(qū)形成一個(gè)polyP選擇性通道，可能采用靜息態(tài)構(gòu)象，其中Vtc4 的閂鎖狀水平螺旋（HH）限制了polyP的進(jìn)入。Vtc4的催化中心結(jié)構(gòu)域位于贗對(duì)稱polyP 通道的頂部，為新合成的polyP 創(chuàng)造了一個(gè)強(qiáng)正電性通路，該通路可以將合成與易位耦合。Vtc4 的水平螺旋以及亞基間多對(duì)保守的鹽橋形成的“離子鎖”有助于探究polyP通道的門控機(jī)制?；谝陨辖Y(jié)構(gòu)和功能信息，推測(cè)了一個(gè)簡(jiǎn)化的VTC激活機(jī)制模型。

Fig. 4 Structure of the intact VTC complex圖4 完整VTC復(fù)合體的結(jié)構(gòu)

在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉主課題組的文章中，作者利用Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域的三突變（R264A/R266A/E426N）和PP-InsPs的商業(yè)化替代品InsP6解析了處于激活態(tài)的VTC的結(jié)構(gòu)。他們發(fā)現(xiàn)，PP-InsP只是特異性結(jié)合在SPXVtc4，而非SPXVtc3，暗示只有SPXVtc4發(fā)揮感知PP-InsP 信號(hào)的功能。同樣地，作者也證實(shí)VTC偶聯(lián)polyP的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，作者運(yùn)用smFRET 技術(shù)，在單分子水平研究了VTC感知PP-InsP 信號(hào)后結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，PP-InsP 作為信號(hào)分子，它結(jié)合Vtc4，通過別構(gòu)調(diào)控，誘導(dǎo)VTC的構(gòu)象發(fā)生變化，使polyP的合成結(jié)構(gòu)域向跨膜通道靠近，VTC 從抑制態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顟B(tài)，開啟polyP的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)。

雖然這兩個(gè)結(jié)構(gòu)是高度相似的，但是也存在一些差異。首先，在apo state中，Vtc4中心結(jié)構(gòu)域的隧道狀口袋中包含三磷酸鹽-Mn2+，這可能與復(fù)合體的內(nèi)源性表達(dá)相關(guān)，相反，在InsP6結(jié)合的激活態(tài)中，Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域的隧道狀口袋被一個(gè)InsP6分子占據(jù)，這或許是因?yàn)? mmol/L 的InsP6并非生理濃度而導(dǎo)致的非特異性結(jié)合。除此之外，結(jié)構(gòu)中還包含另外2個(gè)InsP6分子，1個(gè)結(jié)合在Vtc4 SPX結(jié)構(gòu)域的肌醇多磷酸鹽（PP-InsPs）結(jié)合表面，另外1 個(gè)結(jié)合在Vtc3 和Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域之間，可能促進(jìn)了這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合（圖4）。其次，在靠近胞質(zhì)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)通道的入口處，在apo state中，Vtc4的一段水平螺旋（horizonal helix，HH）橫跨在入口，堵塞polyP的進(jìn)入，相反，在InsP6結(jié)合的激活態(tài)中，兩個(gè)磷酸鹽分子在通道入口處（圖4）。再次，在apo state 中，由Vtc1 的M42、Vtc3 的L716和Vtc4的L640 組成了轉(zhuǎn)運(yùn)通道的最窄點(diǎn)，直徑僅有4 ?，小于polyP 的鮑林半徑（3 ?），不允許polyP 通過，而在InsP6結(jié)合的激活態(tài)中，Vtc1 的R31、Vtc3的R709和Vtc4的R629組成了轉(zhuǎn)運(yùn)通道的最窄點(diǎn)，直徑僅有3 ?，同樣地不允許polyP 通過。最后，在apo state 中，內(nèi)源性表達(dá)的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體具有完全的polyP 合成活性，相反，在InsP6結(jié)合的激活態(tài)中，包含3 個(gè)突變的Vtc4R264A/R266A/E426N/Vtc3/Vtc1復(fù)合體的polyP合成活性被完全廢除。這兩個(gè)處于不同狀態(tài)的結(jié)構(gòu)展示了完整VTC 復(fù)合體的化學(xué)計(jì)量比和組裝方式，極大地推動(dòng)了后續(xù)VTC復(fù)合體的功能研究。

3 VTC復(fù)合體的功能

酵母中polyP 聚合酶是一種大型膜蛋白復(fù)合物，最初被命名為VTC［30］。在其polyP聚合酶的催化活性被確定之前，VTC 復(fù)合物被發(fā)現(xiàn)是V-ATP酶穩(wěn)定性和運(yùn)輸、酵母液泡膜融合和微自噬所必需的［31，37-38］，但是目前并不清楚是polyP還是VTC復(fù)合物本身參與了這些過程。VTC 復(fù)合體作為唯一已知的真核生物polyP聚合酶，利用ATP在胞質(zhì)中合成polyP，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中儲(chǔ)存，以維持細(xì)胞內(nèi)Pi穩(wěn)態(tài)。因此，VTC復(fù)合體具有polyP聚合酶和轉(zhuǎn)位酶的雙重功能。在細(xì)胞內(nèi)，VTC 復(fù)合物的活性受到肌醇磷酸鹽信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，包括高度磷酸化、可擴(kuò)散的肌醇多磷酸鹽（InsPs）和肌醇焦磷酸鹽（PP-InsPs）［28，34］。具體研究詳述如下。

3.1 VTC復(fù)合體偶聯(lián)polyP的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)

VTC復(fù)合體不僅是一個(gè)polyP聚合酶，還是一個(gè)polyP 轉(zhuǎn)位酶。為了避免polyP 在胞質(zhì)中的積累對(duì)細(xì)胞造成的毒害作用，polyP 的合成和立即轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡是偶聯(lián)的［29，39］。最近獲得的兩個(gè)完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)都清晰地支持這種偶聯(lián)機(jī)制［35-36］。

在完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)中，Vtc4的中心結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域是共價(jià)連接的（圖5）。Vtc4作為催化亞基，負(fù)責(zé)polyP的合成，Vtc4敲除顯著降低細(xì)胞內(nèi)polyP含量［40］。Vtc4中心結(jié)構(gòu)域的隧道狀口袋分布著眾多保守的堿性氨基酸（K200、R264、 R266、 K281、 R361、 K458）、 絲 氨 酸（S457）和酪氨酸（Y359），這些氨基酸已經(jīng)被證實(shí)在polyP合成中發(fā)揮著重要作用［27，35］。一段由眾多堿性氨基酸（R196、 R253、 K256、 K291、K294、R373、K428、K455、R618）組成的蜿蜒曲折通道連接了Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)和跨膜通道入口，暗示新生的polyP可能從此通道行進(jìn)到跨膜孔，從而完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。這一結(jié)構(gòu)信息為polyP 合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制提供了理論支持。同時(shí)，這些堿性氨基酸突變成酸性氨基酸也已經(jīng)被證實(shí)能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)polyP的含量［35］。

Fig. 5 The structure of the Vtc4 /Vtc3 /Vtc1 complex supports a coupled mechanism of polyP synthesis and transport圖5 Vtc4/Vtc3/Vtc1復(fù)合體的結(jié)構(gòu)支持polyP合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制

Vtc4、Vtc3和3個(gè)Vtc1的跨膜螺旋以贗對(duì)稱的方式排列成異源五聚體。每個(gè)亞基的TM1 螺旋形成圓柱體的內(nèi)環(huán)作為polyP轉(zhuǎn)運(yùn)的核心通道，每個(gè)亞基的TM2 和TM3 螺旋形成圓柱體的外環(huán)包裹著內(nèi)環(huán)。在apo state 和InsP6-activated state 結(jié)構(gòu)中，由于最窄點(diǎn)直徑都小于polyP直徑，因此，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道都不允許polyP通過。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在靠近胞質(zhì)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)通道的入口處，在apo state中，Vtc4的一段HH 橫跨在入口，堵塞polyP 的進(jìn)入，相反，在InsP6結(jié)合的激活態(tài)中，2個(gè)磷酸鹽分子在通道入口處（圖4）。由于2個(gè)結(jié)構(gòu)被捕獲在不同的功能狀態(tài)，因此結(jié)構(gòu)差異也是合理的。

生化實(shí)驗(yàn)也顯示，單獨(dú)表達(dá)的Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出很低的polyP合成活性，而完整的VTC復(fù)合體在體內(nèi)具有很高的活性［27，29］，而且相比于去垢劑溶解的VTC 復(fù)合體，攜帶VTC 復(fù)合體的液泡表現(xiàn)出超過100 倍的polyP 合成活性［29］，這表明VTC 復(fù)合體的完全催化活性需要一個(gè)完整的膜環(huán)境。因此，提出polyP合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制也是合理的，其中來自跨膜區(qū)域的驅(qū)動(dòng)力將新生的polyP 鏈拉入跨膜通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，從而將帶負(fù)電的聚合物從帶正電的催化中心排出，并允許添加新的磷酸鹽殘基。

3.2 肌醇多磷酸鹽（PP-InsPs）調(diào)控polyP的合成

VTC復(fù)合體精確調(diào)控polyP的合成對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)Pi穩(wěn)態(tài)是必需的。包含SPX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控Pi穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用［41］。單獨(dú)表達(dá)的SPX 結(jié)構(gòu)域能夠與含磷酸鹽的配體發(fā)生相互作用，但對(duì)Pi本身表現(xiàn)出很小的特異性和選擇性［28］。PP-InsPs 也被發(fā)現(xiàn)在控制酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞磷酸鹽穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用［42-43］。VTC復(fù)合體的polyP合成活性在體內(nèi)收到肌醇焦磷酸鹽（5-InsP7和1,5-InsP8等）的調(diào)控［28］，同時(shí)肌醇磷酸鹽（InsP6）也被發(fā)現(xiàn)在體外能夠刺激VTC 復(fù)合體合成polyP［28，35-36］。

SPX結(jié)構(gòu)域存在于所有真核生物中，并具有共同的序列和結(jié)構(gòu)特征，保守的賴氨酸殘基形成肌醇多磷酸鹽和焦磷酸鹽的高親和力（亞微摩爾）結(jié)合位點(diǎn)［28］。純化的SPX 結(jié)構(gòu)域在結(jié)合不同的肌醇多磷酸鹽或焦磷酸鹽異構(gòu)體方面表現(xiàn)出相對(duì)較低的選擇性，并且它們的親和力隨化合物的凈電荷降低而降低（InsP8>InsP7>InsP6）［34］。與低選擇性形成鮮明對(duì)比的是，不同異構(gòu)體的激動(dòng)劑性質(zhì)差異很大。例如，VTC復(fù)合體被1,5-InsP8強(qiáng)烈激活，但被攜帶相同數(shù)量磷酸基團(tuán)的5-PPP-InsP5激活效果非常弱［34］。同樣地，5-InsP7激活VTC，而InsP6幾乎沒有作用［34］。因此，盡管肌醇多磷酸鹽具有極高的電荷密度及其類似的結(jié)合親和力，SPX結(jié)構(gòu)域必須解碼配體的精確結(jié)構(gòu)特征，并將其轉(zhuǎn)化為不同程度的活性。

釀酒酵母的基因組包含10 個(gè)編碼SPX 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，其中8種蛋白質(zhì)具有與Pi代謝相關(guān)的功能。它們分別是：2 個(gè)低親和力Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)Pho87 和Pho90 定位在細(xì)胞膜上［13，44］；Pho91 位于液泡膜上并參與將Pi從液泡輸出到細(xì)胞質(zhì)［14］；細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑Pho81［45］；甘油磷酸膽堿磷酸二酯酶1（Gde1），可水解甘油磷酸膽堿，從而釋放膽堿和甘油3-磷酸，可作為Pi來源［46］；酵母gpa1 抑制劑（Syg1）［47］和Ydr089（最近被鑒定為Vtc5）［32］；多聚磷酸鹽聚合酶VTC復(fù)合體的3個(gè) 亞 基Vtc2、Vtc3 和Vtc4［48］。除 了Syg1 和Ydr089 之外，所有含有SPX 結(jié)構(gòu)域的酵母蛋白都被證明是維持酵母中Pi穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

Vtc3和Vtc4 SPX結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)是高度相似的，135個(gè)Cα原子的均方根偏差為1.7 ?。相比于Vtc4，Vtc3 的SPX 結(jié)構(gòu)域在C 端還包含1 個(gè)額外的螺旋αVII，與αIV 和αVI 螺旋形成疏水相互作用（圖6）。兩個(gè)SPX 結(jié)構(gòu)域都具有由螺旋αII 和αIV 上的多個(gè)保守賴氨酸殘基形成的帶正電荷的表面（圖6），并且可以與含磷酸鹽的配體相互作用，在之前的研究中猜測(cè)兩者都是PP-InsPs 的受體［28］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，不論是對(duì)SPX 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行截?cái)啵?5］，還是對(duì)SPX 結(jié)構(gòu)域上的保守賴氨酸殘基突變［36］，攜帶突變體的VTC復(fù)合體體外polyP合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明，只有Vtc4 的SPX 結(jié)構(gòu)域能夠作為PP-InsPs感受器，響應(yīng)polyP合成和PP-InsPs調(diào)節(jié)。與此相一致，在InsP6-activated state 結(jié)構(gòu)中，InsP6只結(jié)合在Vtc4 的SPX 結(jié)構(gòu)域上（InsP6A）［36］。同時(shí)，在Vtc3 和Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域之間也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)InsP6B，可能促進(jìn)了這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合［36］。

除此之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，Vtc3 通過磷酸化的loop 調(diào)控polyP 的合成［35］。在Vtc3 的非催化中心結(jié)構(gòu)域中存在一段不同尋常的loop（殘基234~292），在該loop 的C 端包含一簇磷酸化位點(diǎn)。研究人員通過取代6 個(gè)絲氨酸殘基（S263、S265、S267、S269、S270、S274）為丙氨酸或天冬氨酸來模擬該loop 的非磷酸化和磷酸化狀態(tài)，證實(shí)該loop 的磷酸化對(duì)polyP 的合成具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。結(jié)合PP-InsPs 對(duì)VTC 復(fù)合體的調(diào)控作用，該loop 可以增強(qiáng)VTC調(diào)節(jié)polyP合成活性的動(dòng)態(tài)范圍，支持在Pi缺乏的情況下完全停止polyP 合成，同時(shí)在Pi充足時(shí)保持完全激活的潛力。

Fig. 6 Structure of the SPX domain of the VTC complex圖6 VTC復(fù)合體的SPX結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征

3.3 VTC復(fù)合體的激活機(jī)制

完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)意想不到的異源五聚體組裝，包含1 個(gè)Vtc4、1 個(gè)Vtc3 和3 個(gè)Vtc1 亞基。Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域與跨膜區(qū)的連接以及二者之間形成的轉(zhuǎn)運(yùn)通道結(jié)構(gòu)清晰地支持polyP合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制。Vtc4的SPX結(jié)構(gòu)域作為PP-InsPs 感受器，響應(yīng)polyP 合成和PP-InsPs 調(diào)節(jié)。Vtc3 通過磷酸化的loop 調(diào)控polyP的合成?；谶@兩個(gè)處于不同功能狀態(tài)的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能信息，允許大家合理地推測(cè)一個(gè)VTC復(fù)合體的激活機(jī)制。

在apo state結(jié)構(gòu)中，研究人員提出了一種可能的polyP通道門控機(jī)制［35］。首先，作者發(fā)現(xiàn)由TM1螺旋組成的polyP 通道的五重對(duì)稱性被破壞。同時(shí)，觀察到形成界面的2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域具有不同的相對(duì)位置，其中Vtc1（β）-Vtc1（γ）和Vtc3-Vtc4緊密堆積，Vtc1（γ）-Vtc3松散堆積，Vtc1（α）-Vtc1（β）和Vtc4-Vtc1（α）介于二者之間。相應(yīng)地，Vtc3-Vtc4掩埋了最多的蛋白質(zhì)表面積（4 150 ?2），接下來分別是Vtc1（β）-Vtc1（γ） （2 920 ?2）、Vtc4-Vtc1（α）（2 870 ?2）和Vtc1（α）-Vtc1（β） （2 660 ?2）。Vtc1（γ）- Vtc3 相互作用界面掩埋了最少的蛋白質(zhì)表面積（2 350 ?2），這一數(shù)據(jù)也與觀察到的VTC 通道不對(duì)稱性相一致。有趣的是，在以疏水相互作用為主的亞基相互作用界面中心發(fā)現(xiàn)了幾對(duì)特殊的鹽橋，將其命名為亞基間“離子鎖”。其中Vtc1 的E30 和R83、Vtc3 的E704 和R762，以 及Vtc4 的E628 和R681 都是非常保守的（圖7a）?；诖?，作者假設(shè)polyP通道在靜息狀態(tài)下被捕獲，入口由Vtc4 的閂鎖狀水平螺旋固定。Vtc4 的水平螺旋在通道入口處的不對(duì)稱排列對(duì)polyP通道施加了不對(duì)稱的力，導(dǎo)致亞基間相互作用界面的相對(duì)位置不同。3 個(gè)松散堆積的亞基間相互作用界面，加上2個(gè)緊密堆積的亞基間相互作用界面，使得由TM1螺旋形成的通道直徑從胞質(zhì)側(cè)向液泡內(nèi)側(cè)逐漸變窄，形成一個(gè)可能用作門控的最窄點(diǎn)。亞基間的“離子鎖”可以將各亞基維持在一起。然而，在polyP 通道打開期間，水平螺旋閂鎖被抬起，VTC復(fù)合體的各亞基被“離子鎖”拉在一起，可能導(dǎo)致亞基之間形成所有的5個(gè)“離子鎖“。在這種狀態(tài)下，TM1 螺旋可能在胞質(zhì)側(cè)向內(nèi)傾斜，在液泡側(cè)向外傾斜，從而打開通道（圖7b）。

相反，在InsP6-activated state 結(jié)構(gòu)中，作者認(rèn)為PP-InsPs 的結(jié)合使得Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域向跨膜通道入口靠近，從而偶聯(lián)polyP 的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)［36］。作者認(rèn)為Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域的取向主要由Vtc4 中心結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域間的連接以及與Vtc1（α）的N端（殘基1~21）之間相互作用來維持。其中Vtc1（α） N端的敲除會(huì)降低VTC復(fù)合體的催化活性，完全廢除液泡polyP的產(chǎn)生。為了闡明Vtc1的N端缺失是否會(huì)導(dǎo)致Vtc4 催化結(jié)構(gòu)域的運(yùn)動(dòng)，作者進(jìn)行了單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）分析，這是一種單分子水平表征蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)和構(gòu)象變化的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，InsP6的結(jié)合使得Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域靠近跨膜結(jié)構(gòu)域，遠(yuǎn)離跨膜結(jié)構(gòu)域。而且，Vtc1 的N 端缺失會(huì)導(dǎo)致VTC 復(fù)合體不再被InsP6激活。

基于處于不同功能狀態(tài)的2 種Vtc4/Vtc3/Vtc1復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，本課題組推測(cè)了一個(gè)可能的VTC復(fù)合體的激活機(jī)制（圖7c）。我們認(rèn)為VTC復(fù)合體包含1個(gè)polyP聚合酶和1個(gè)polyP通道，并在非活性狀態(tài)和活性狀態(tài)之間平衡存在。在非活性狀態(tài)，Vtc4 的中心結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)離跨膜通道，polyP 合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制被破壞，具有很低的聚合酶活性，同時(shí)Vtc4 的水平螺旋HH 堵塞在通道入口使得polyP轉(zhuǎn)運(yùn)通道處于關(guān)閉狀態(tài)；在肌醇磷酸等信號(hào)分子的刺激下，Vtc4的中心結(jié)構(gòu)域在Vtc1（α） N端的幫助下靠近polyP 轉(zhuǎn)運(yùn)通道，完成polyP 合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)，同時(shí)，Vtc4的水平螺旋HH遠(yuǎn)離通道入口使得polyP轉(zhuǎn)運(yùn)通道處于開放狀態(tài)，VTC復(fù)合體從非活性狀態(tài)快速轉(zhuǎn)變成活性狀態(tài)，高效催化ATP 合成polyP。

Fig. 7 Activation mechanisms of the VTC complex圖7 VTC復(fù)合體的激活機(jī)制

進(jìn)一步，之前的研究也報(bào)道了液泡polyP 的合成需要一個(gè)跨膜電化學(xué)勢(shì)能，可能由位于液泡上的V-ATPase 提供［29，49］。在體內(nèi)，通過添加V-ATPase的抑制劑可以抑制液泡polyP 的合成；同時(shí)，V-ATPase 亞基Vph1 的敲除會(huì)使得酵母細(xì)胞內(nèi)polyP含量降低20%（相比野生型）［29］?；趐olyP合成缺陷突變體的高通量篩選已經(jīng)識(shí)別了超過250種相關(guān)基因，其中也包括V-ATPase 的幾個(gè)亞基［50］。因此，跨膜區(qū)內(nèi)外的質(zhì)子梯度及其對(duì)細(xì)胞應(yīng)激的變化或許將調(diào)節(jié)VTC 的活性，如通道本身的構(gòu)象變化，從而刺激polyP的合成和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

4 總結(jié)與展望

釀酒酵母VTC復(fù)合體作為已知的真核polyP合成酶，通過偶聯(lián)polyP的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程來維持細(xì)胞內(nèi)Pi穩(wěn)態(tài)。近十年來，隨著VTC 復(fù)合體的相關(guān)研究逐漸增多，其結(jié)構(gòu)信息和作用機(jī)制也越來越清晰。最近發(fā)表的完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)極大地推動(dòng)了對(duì)VTC 復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能的理解。完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)異源五聚體組裝，結(jié)構(gòu)和功能信息都支持polyP合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的偶聯(lián)機(jī)制。Vtc4的SPX結(jié)構(gòu)域作為PP-InsPs感受器，響應(yīng)polyP 合成和PP-InsPs 調(diào)節(jié)，同時(shí)Vtc3 通過磷酸化的loop 調(diào)控polyP 的合成。基于Vtc2 和Vtc3 在序列上的高度同源，Vtc4/Vtc2/Vtc1復(fù)合體可能采取和Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體相似的化學(xué)計(jì)量比和組裝方式。目前還不清楚酵母細(xì)胞內(nèi)為什么存在兩種VTC復(fù)合體。相比Vtc4/Vtc3/Vtc1復(fù)合體只定位在液泡膜上，Vtc4/Vtc2/Vtc1 復(fù)合體在酵母細(xì)胞的定位隨環(huán)境中Pi的濃度而發(fā)生變化，這種廣泛的分布（細(xì)胞核膜、線粒體膜、細(xì)胞膜和液泡膜等）或許暗示Vtc4/Vtc2/Vtc1 復(fù)合體不僅具有polyP 聚合酶和轉(zhuǎn)位酶活性，或許還參與細(xì)胞內(nèi)其他生物學(xué)功能。因此，解析Vtc4/Vtc2/Vtc1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)對(duì)于理解VTC 復(fù)合體的作用機(jī)制也是十分有幫助的。最近，雖然發(fā)表了處于兩種不同功能狀態(tài)的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復(fù)合體結(jié)構(gòu)，但是二者結(jié)構(gòu)的高度相似性或許暗示VTC 復(fù)合體的激活可能不需要大的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，目前的結(jié)構(gòu)信息還不足以闡明VTC 復(fù)合體的分子作用機(jī)制。因此，未來獲得其他功能狀態(tài)的結(jié)構(gòu)（包括polyP催化合成的不同階段以及轉(zhuǎn)運(yùn)通道完全開放狀態(tài)的結(jié)構(gòu)等）對(duì)于理解VTC復(fù)合體的分子作用機(jī)制是十分重要的。