張和平，王敬敏，任 萍

(1.焦作市人民醫(yī)院肛腸科,河南 焦作 454000;2.焦作市人民醫(yī)院不孕不育門診,河南 焦作 454000;3.焦作市人民醫(yī)院耳鼻喉科,河南 焦作 454000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。隨著經(jīng)濟的發(fā)展、飲食習慣和生活方式的改變,CRC發(fā)病率和病死率逐年上升,且發(fā)病呈年輕化趨勢[1]。CRC的發(fā)生是一個復雜的多基因、多步驟、多階段過程,常常多個基因相互作用,包括癌基因激活和抑癌基因失活[2]。因此,尋找調(diào)控CRC發(fā)生發(fā)展的核心基因和有效的治療靶點是當前研究的重點。本研究使用WGCNA方法,基于148個人類CRC樣本的2 000個基因組成的數(shù)據(jù)集構(gòu)建共表達網(wǎng)絡,分析各模塊與CRC臨床特征的相關性,尋找與腫瘤進展高度相關的基因,以期為CRC的臨床治療提供靶點。

1 資料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器CRC細胞株LOVO、SW620、HCT116、SW480、RKO、CaCo2和對照腸黏膜上皮細胞NCM460均來自ATCC細胞庫。胎牛血清購自美國Gibco公司,TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I購自日本TaKaRa公司,細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購自江蘇凱基生物技術有限公司,CYTH1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物序列信息來自Primer Bank數(shù)據(jù)庫,si-NC、si-CYTH1干擾片段購自蘇州吉瑪基因有限公司;細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司,酶標儀UMR9600購自杭州優(yōu)米儀器有限公司,Transwell過濾器購美國康寧公司。

1.2 數(shù)據(jù)來源與CRC相關的數(shù)據(jù)來自NCBI基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo),數(shù)據(jù)集為GSE21510,共148個樣本,芯片平臺為GPL570。使用GEO2R工具對差異基因進行分析,根據(jù)P值和基因表達fold-change對差異基因進行排序[3-4],選擇前2 000個樣本進行進一步分析。

1.3 CRC共表達模塊的分析與構(gòu)建使用下載的CRC芯片基因表達數(shù)據(jù)構(gòu)建無標度網(wǎng)絡,用加權基因共表達網(wǎng)絡分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)算法繼續(xù)進行模塊構(gòu)建,在R包(http:/www.r-project.org/)中運行WGCNA,分析與臨床性狀之間的交互強度[5-6]。估算出模塊與臨床特征的相關性,鑒定出與臨床表型高度相關的模塊[7-8];以P<0.05的模塊為顯著相關的模塊。

1.4 Cytoscape分析模塊的核心基因提取與臨床特征相關性最高的模塊內(nèi)基因,將基因?qū)隒ytoscape,分析核心基因,用MCODE插件篩選核心蛋白[9]。選擇與其他基因連接最多的樞紐基因CYTH1為核心基因。

1.5 細胞培養(yǎng)將LOVO、SW620、HCT116、SW480、RKO、CaCo2和NCM460細胞接種于含 RPMI 1640 (Hyclone)的培養(yǎng)基中,添加胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.6 實時熒光定量-聚合酶鏈式反應 (quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測細胞中CYTH1表達取對數(shù)生長期LOVO、SW620、HCT116、SW480、RKO、CaCo2和NCM460細胞,使用TRIzol試劑提取總RNA;利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Green I對樣品進行qRT-PCR分析。CYTH1正向引物序列為5′-GACGACAGCTACGTTCCCAG-3′,反向引物序列為5′-TCCTGTTCTCCGTCGGATG-3′,擴增產(chǎn)物大小為140 bp。內(nèi)參為GAPDH[10],GAPDH正向引物序列為5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′,反向引物序列為5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。反應體系:TB-Green 10.0 μL,滅菌蒸餾水 6.8 μL,cDNA溶液 2.0 μL,上下游引物各0.4 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL;反應條件為:95 ℃預變性1 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸34 s,共40循環(huán),檢測各樣品的Ct值,采用2-ΔΔCt法計算CYTH1在各細胞中的相對表達量。應用GraphPad Prism 6軟件進行圖形構(gòu)建[11]。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖能力取對數(shù)生長期HCT116和SW480細胞,分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-CYTH1干擾片段,轉(zhuǎn)染基因干擾片段后24 h以每孔1 000個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中進行培養(yǎng),每孔100 μL,每孔加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃繼續(xù)孵育2 h。在酶標儀上于450 nm波長處測定每孔的吸光度(absorbance,A) 值,連續(xù)監(jiān)測4 d,根據(jù)數(shù)值繪制細胞增殖曲線,并計算細胞增殖率。實驗重復3次,取均值。

1.8 Transwell實驗檢測細胞遷移率取對數(shù)生長期HCT116和SW480細胞,分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-CYTH1干擾片段,24 h后將si-NC-HCT116、si-CYTH1-HCT116、si-NC-SW480、si-CYTH1-SW480細胞用胰酶消化后,反復吹打細胞懸液,使細胞充分分散,于顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)量。細胞計數(shù)后每個小室接種 250 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的細胞懸液,每個小室中(1～5)×105個細胞,下室加入600 μL含體積分數(shù)20%血清的1640 培養(yǎng)基;培養(yǎng)24 h后,在顯微鏡下(×200)觀察穿過微孔進入下室的細胞,計算遷移細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 CRC數(shù)據(jù)集的預處理結(jié)果使用GEO2R軟年對差異表達基因進行分析,發(fā)現(xiàn)45 198個基因的P值均大于0.05。根據(jù)P值對差異基因進行排序,使用flashClust函數(shù)對前2 000個基因進行聚類分析。對樣本進行聚類以檢測離群值,所有樣本都在聚類中,白色為低,紅色為高。結(jié)果顯示,148個樣本產(chǎn)生了2個主簇,其中正常組織有25個樣本,腫瘤組織有123個樣本(圖1)。

圖1 CRC相關樣本的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of samples associated to CRC

2.2 共表達模塊應用WGCNA方法對148個樣本的 2 000 個基因數(shù)據(jù)集進行分析。構(gòu)建WGCNA時,選擇軟閾值來進行共表達相鄰基因相似度篩選?；跓o標度拓撲準則,根據(jù)擬合指數(shù)和網(wǎng)絡平均連接程度,確定相關系數(shù)接近0.90時,最佳軟閾值β=12,并構(gòu)建基因網(wǎng)絡(圖2)。

A:soft threshold (power)表示權重,縱坐標表示無標度拓撲模型擬合;B:soft threshold (power)表示權重,縱坐標表示平均連接度。圖2 共表達模塊軟閾值的確定Fig.2 Determination of soft threshold in coexpression module

2.3 各模塊與臨床特征的相關性結(jié)果見圖3。WGCNA構(gòu)建的模塊用不同顏色表示,不屬于任何模塊的基因被放置在灰色模塊中?；疑蚰K在本研究中被忽略。計算基因表達模塊的關聯(lián),中間的黃色部分表示模塊之間的相關性。橫軸和縱軸的不同顏色代表不同的模塊。淺顏色表示拓撲重疊小,深顏色表示拓撲重疊大。分析模塊與臨床特征的相關性,每一行對應一個模塊特征基因,列對應一個臨床特征。每個單元格包含相應的相關性和P值。結(jié)果顯示,turquoise模塊與CRC臨床轉(zhuǎn)移特征顯著相關。繪制特征基因與臨床性狀相關的散點圖,發(fā)現(xiàn)turquoise模塊核心基因與腫瘤轉(zhuǎn)移呈明顯相關性,藍色模塊基因與腫瘤轉(zhuǎn)移無明顯相關性。

A:CRC共表達基因聚類樹型圖;B:基因表達模塊的關聯(lián);C:模塊與臨床特征的關聯(lián);D:藍色模塊特征基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關性;E:Turquoise模塊特征基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關性。圖3 各模塊與臨床性狀的相關性Fig.3 Correlation of each module and clinical characteristics

2.4 核心基因篩選結(jié)果見圖4。將turquoise模塊基因及其相關文件導入Cytoscape軟件,分析核心基因。因為第一個模塊包含的基因太多,超過1 000條邊,所以只顯示關鍵基因,黃色為核心基因。Cytoscape 軟件識別出了排名前3位的核心模塊,3個模塊中的核心基因分別為CYTH1、LOC157273和RP11-744D14.2,其中,與其他基因連接最多的樞紐基因是CYTH1。

圖4 前3位的核心模塊中核心基因的可視化Fig.4 Visualization of core genes in the top three core modules

2.5 CYTH1 mRNA在結(jié)直腸癌組織與癌旁組織、對照結(jié)直腸組織及7種細胞中的表達水平比較基于Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,CRC組織中CYTH1 mRNA表達水平顯著下調(diào);與對照結(jié)直腸組織標本相比,CRC標本中CYTH1表達下調(diào)約75%(圖5)。RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示,LOVO、SW620、HCT116、SW480、RKO、CaCo2和NCM460細胞中CYTH1 mRNA相對表達量分別為0.104±0.050、0.185±0.066、0.261±0.024、0.544±0.255、0.227±0.011、0.084±0.001、0.999±0.003。LOVO、SW620、HCT116、SW480、RKO和CaCo2細胞中CYTH1 mRNA相對表達量顯著低于NCM460,差異有統(tǒng)計學意義(t=31.080、21.262、51.963、3.093、114.344、216.340,P<0.001)。

紅色框表示表達上調(diào),藍色表示下調(diào)。圖5 基于Oncomine數(shù)據(jù)庫CYTH1 mRNA在結(jié)直腸癌組織和對照組織中的表達水平Fig.5 Expression levels of CYTH1 mRNA in colorectal cancer tissues and control tissues based on Oncomine database

2.6 CYTH1對HCT116和SW480細胞增殖和遷移能力的影響結(jié)果見圖6。干預1、2、3、4 d,si-NC-HCT116細胞增殖率分別為-(4.44±18.46)%、(258.33±92.04)%、(51.76±29.17)%、(49.66±22.17)%,si-CYTH1-HCT116細胞增殖率分別為-(13.77±36.64)%、(317.86±151.72)%、(69.59±20.14)%、(33.65±3.09)%;不同時間點,si-NC-HCT116細胞與si-CYTH1-HCT116增殖率比較差異無統(tǒng)計學意義(t= 0.321、-0.474、-0.711、1.011,P>0.05)。si-NC-SW480細胞增殖率分別為-(0.36±3.80)%、(488.89±164.05)%、 (124.17±27.41)%、(43.18±18.97)%,si-CYTH1-SW480細胞增殖率分別為-(0.23±4.23)%、(550.00±298.45)%、(123.00±31.11)%、(40.90±8.00)%;不同時間點,si-NC-SW480 細胞與si-CYTH1-SW480細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學意義(t= 0.148、-0.254、0.040、0.157,P>0.05)。培養(yǎng)24 h后,si-NC-HCT116、si-CYTH1-HCT116 遷移細胞數(shù)分別為 24.60±2.65、86.80±6.68,si-CYTH1-HCT116遷移細胞數(shù)顯著高于si-NC-HCT116細胞,差異有統(tǒng)計學意義(t=-17.318,P<0.001);si-NC-SW480、si-CYTH1-SW480 細胞遷移率分別為53.20±4.96、80.80±4.96,si-CYTH1-SW480 遷移細胞數(shù)顯著高于si-NC-SW480細胞,差異有統(tǒng)計學意義(t=-7.876,P<0.001)。

3 討論

WGCNA是一種用于復雜樣本[12]的分析方法,利用高通量測序數(shù)據(jù)獲取模塊信息。在這種方法中,一個模塊包括一組具有相似表達譜的基因。如果某些基因在生理過程中或在不同的組織中始終有類似的表達變化,那么這些基因是功能相關的,然后將它們定義為一個模塊。當定義了一個基因模塊后,可以利用模塊與臨床特征的相關性結(jié)果,找到最相關的基因模塊,重點分析其中的基因[13]。WGCNA 可以描述不同樣本之間的基因關聯(lián)模式,可用于識別高度相關的基因集[14-15]。聚類分析僅僅考慮了單個基因之間表達模式相似度,而忽略了多個基因間的表達相關性,會損失一部分信息[16-17]。與只關注差異表達的基因相比,WGCNA利用變化最大的基因信息來識別感興趣的基因,并與表型進行關聯(lián)分析[18]。本研究使用WGCNA方法分析基因表達數(shù)據(jù),由于輸入基因數(shù)量有限,選擇了 2 000 個差異最大的基因,并用WGCNA對NCBI獲得的148個樣本的2 000個不同表達基因進行了研究,最終確定了3個基因模塊。

惡性腫瘤的主要生物學特征是其具有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力,這是腫瘤患者復發(fā)和死亡的主要原因。CRC的轉(zhuǎn)移過程是動態(tài)的,其發(fā)生機制非常復雜。為了分析CRC轉(zhuǎn)移的相關基因集,本研究使用WGCNA方法將獲得的模塊與臨床特征聯(lián)系起來,結(jié)果發(fā)現(xiàn),turquoise模塊與轉(zhuǎn)移關系最為密切;將turquoise模塊基因?qū)隒ytoscape進行分析,得到3個核心基因CYTH1、LOC157273和 RP11-744D14.2,其中,與其他基因連接最多的樞紐基因是CYTH1。CYTH1是細胞黏附蛋白家族成員,在自然殺傷細胞和外周血T細胞中高表達,調(diào)控整合素在淋巴細胞細胞膜上的黏附[19-20]。該家族成員具有相同的結(jié)構(gòu),包括N端卷曲螺旋基序、中央的Sec7結(jié)構(gòu)域和C端PH結(jié)構(gòu)域[21]。本研究基于 Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析了CRC細胞中CYTH1的mRNA表達水平,結(jié)果顯示,CRC組織中CYTH1 mRNA表達水平顯著低于癌旁組織, CRC組織中CYTH1表達水平較對照組結(jié)直腸組織下調(diào)75%。另外,本研究結(jié)果顯示,SW620、HCT116、SW480、RKO和CaCo2細胞中CYTH1相對表達量顯著低于NCM460;說明CYTH1在CRC中有可能是抑癌基因。

本研究進一步檢測CYTH1對CRC細胞增殖和遷移的影響,結(jié)果顯示,不同時間點,si-NC-HCT116細胞與si-CYTH1-HCT116增殖率比較差異無統(tǒng)計學意義,且si-NC-SW480細胞與si-CYTH1-SW480增殖率比較差異亦無統(tǒng)計學意義,說明CYTH1對CRC細胞的增殖無明顯影響。另外,本研究結(jié)果顯示,培養(yǎng)24 h后,si-CYTH1-HCT116細胞遷移率顯著高于si-NC-HCT116,且si-CYTH1-SW480細胞遷移率顯著高于si-NC-SW480細胞說明 CYTH1可抑制CRC細胞的遷移能力。因此,推測CYTH1可能參與了CRC的進展過程,但具體機制尚不明確,需要進一步的研究。

綜上所述,通過WGCNA分析找到與CRC細胞遷移相關的核心基因CYTH1,CYTH1在CRC組織和細胞中表達下調(diào),CYTH1可抑制CRC細胞的遷移能力;因此,推測CYTH1在結(jié)直腸癌中起著抑癌作用,且有可能成為CRC有效的治療靶點。