趙 甜，張晨光，龐桂芝

(1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南 新鄉(xiāng) 453000;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;3.新鄉(xiāng)市中心血站血型室,河南 新鄉(xiāng) 453001)

Rh血型是較復(fù)雜的人類(lèi)紅細(xì)胞血型系統(tǒng),Rh血型系統(tǒng)包括55種抗原,其中D抗原的免疫原性最強(qiáng)。當(dāng)個(gè)體紅細(xì)胞上存在D抗原時(shí),稱(chēng)為Rh陽(yáng)性;當(dāng)缺乏D抗原時(shí)稱(chēng)為Rh陰性,目前中國(guó)大部分人為Rh陽(yáng)性。陰性個(gè)體若輸注1個(gè)單位的Rh陽(yáng)性紅細(xì)胞,27%～56%個(gè)體可發(fā)生免疫反應(yīng),產(chǎn)生抗D抗體[1]。因此,需準(zhǔn)確鑒定Rh血型,以便臨床實(shí)施科學(xué)合理的輸血治療方案,避免嚴(yán)重溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病發(fā)生。RHD基因位于人1p34～1p36染色體,由10個(gè)外顯子構(gòu)成。D抗原位于RHD基因編碼的D多肽鏈上,RHD基因的缺失、重組、突變等可引起D抗原表達(dá)異常,導(dǎo)致RhD變異型的產(chǎn)生[2]。由于臨床常規(guī)血清學(xué)方法的局限性,很難正確鑒定RhD變異型,因此,本研究采用血型血清學(xué)試驗(yàn)和基因測(cè)序方法對(duì)新鄉(xiāng)地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者中RhD變異型個(gè)體進(jìn)行基因型分析,了解RHD基因的多態(tài)性特點(diǎn),為構(gòu)建新鄉(xiāng)地區(qū)RhD變異型數(shù)據(jù)庫(kù)及臨床精準(zhǔn)輸血治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年1月至2019年12月于新鄉(xiāng)市中心血站無(wú)償獻(xiàn)血的110 667名無(wú)償獻(xiàn)血者為研究對(duì)象,其中男67 506例,女43 161例;年齡18～55(38.55±10.27)歲。本研究獲新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器ABO血型定型紅細(xì)胞試劑購(gòu)自長(zhǎng)春博德生物制品有限責(zé)任公司,抗-A、抗-B、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)M單克隆抗-D、IgM單克隆抗-E、IgM單克隆抗-e、IgM單克隆抗-C、IgM單克隆抗-c標(biāo)準(zhǔn)血清、抗人球蛋白試劑購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,IgG+IgM抗-D購(gòu)自法國(guó)Diagast公司、美國(guó)Immucor公司,全血基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix(Dye)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,100 bp DNA Ladder Marker購(gòu)自北京賽默飛世爾科技有限公司,Agarose瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest公司;血清學(xué)專(zhuān)用離心機(jī)來(lái)購(gòu)自長(zhǎng)春博研科學(xué)儀器有限責(zé)任公司,調(diào)速型迷你離心機(jī)購(gòu)自上海生物工程公司,臺(tái)式高速低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó) Sigma 公司,核酸蛋白測(cè)定儀、梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司,電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠,凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司;RHD基因外顯子引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 血型血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)ABO血型和Rh血型取受試者乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血2 mL,3 000 r·min-1離心5 min,將紅細(xì)胞沉淀用生理鹽水洗滌3次;吸取50 μL洗滌紅細(xì)胞加入1 mL生理鹽水中,并充分混勻,即得到5%紅細(xì)胞懸液。采用試管法ABO正反定型試驗(yàn)檢測(cè)ABO血型,采用試管法Rh抗原分型試驗(yàn)檢測(cè) Rh表型并初篩RhD陰性受試者,采用3個(gè)不同廠家的抗-D試劑通過(guò)間接抗人球蛋白試驗(yàn)對(duì)初篩RhD陰性受試者進(jìn)行RhD陰性確認(rèn),最終檢出 RhD變異型受試者。以上試驗(yàn)方法及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)均參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]。

1.3.2 PCR法擴(kuò)增RhD變異型受試者RHD基因外顯子取RhD變異型受試者的全血2 mL,加入乙二胺四乙酸二鉀抗凝,使用全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用PCR法擴(kuò)增 RHD基因外顯子E1～E10。PCR擴(kuò)增體系為25.0 μL:樣本DNA 0.8 μL,上、下游引物各0.8 μL,ddH2O 10.1 μL,2×PFU Master Mix 12.5 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,58～60 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸1 min,循環(huán)35次;最后72 ℃延伸5 min。RHD基因外顯子E1～E10引物序列及相應(yīng)PCR擴(kuò)增退火溫度見(jiàn)表1。取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,使用凝膠成像系統(tǒng)成像。根據(jù)DNA Maker條帶和RHD基因外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物的大小,觀察相應(yīng)的外顯子區(qū)域有無(wú)特異性條帶出現(xiàn)。

表1 RHD基因外顯子E1～E10引物Tab.1 Exon E1-E10 primers of RHD gene

1.3.3 Sanger測(cè)序法檢測(cè)RhD變異型的基因分型RhD變異型受試者的RHD基因外顯子E1～E10的PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物由天津金唯智有限公司采用 Sanger測(cè)序法進(jìn)行基因測(cè)序。應(yīng)用SeqMan軟件分析基因序列,根據(jù)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)確定RhD變異型(弱D型、部分D型、DEL型)。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)結(jié)果分析結(jié)果見(jiàn)表2。110 667名受試者中,初篩RhD陰性269例(0.24%)。269例初篩RhD陰性受試者中,Rh陰性256例(95.17%),RhD變異型 13例(4.83%)。256例RhD陰性受試者的ABO血型為A型78例(30.47%)、B型92例(35.94%)、O型64例(25.00%)、AB型22例(8.59%),Rh表型分布以ccdee(60.55%)和Ccdee(29.30%)居多。

表2 RhD陰性受試者的ABO和Rh表型分布頻率Tab.2 ABO and Rh phenotypic distribution frequency of RhD negative subjects 例(%)

2.2 RhD變異型受試者RHD基因外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性分析11例RhD變異型受試者的RHD基因外顯子E1～E10為特異性條帶;2例RhD變異型受試者的RHD基因外顯子E1～E5、E8、E10為特異性條帶。

2.3 RHD基因外顯子的測(cè)序結(jié)果分析結(jié)果見(jiàn)表3。13例RhD變異型受試者中,7例弱D型、4例DEL型和2例部分D型。13例RhD變異型受試者RHD基因RhCE表型分別為CCee(2/13)、Ccee(6/13)和ccEe(5/13)。7例RhD變異型受試者等位基因RHD*15的E6外顯子發(fā)生845 G>A雜合突變。4例RhD變異型受試者的E9外顯子發(fā)生1 227 G>A雜合突變,其中1例受試者同時(shí)發(fā)生IVS7+152 C>A突變。2例RhD變異型受試者的RHD基因E6～E9外顯子發(fā)生突變,被RHCE基因所取代,表現(xiàn)為RHD-CE(6-9)-RHD。

表3 RhD變異型受試者的RHD等位基因、突變位點(diǎn)及表型情況Tab.3 Mutation sites,genotypes and phenotypes of D variant subjects 例

3 討論

Rh血型是一種較為重要的人類(lèi)紅細(xì)胞血型系統(tǒng),RHD基因具有多態(tài)性,RHD基因編碼表達(dá)的抗原在不同種族和地區(qū)分布具有較大的差異。Rh血型除了正常的D陽(yáng)性和D陰性表型外,還包括D變異型(部分D、弱D、DEL)。目前已確認(rèn)的D變異型等位基因達(dá)300多種,中國(guó)人中最常見(jiàn)的類(lèi)型為RHD*15、RHD*DVI.3、RHD*DEL1[4]。弱D型是中國(guó)華北地區(qū)的主要Rh變異型。部分D的氨基酸變異通常發(fā)生在胞外環(huán)區(qū)域,主要包括細(xì)胞外環(huán)錯(cuò)義突變、散在錯(cuò)義突變和RHD-CE-D融合基因[5]。RHD與RHCE基因約有96%的同源性,其外顯子1、8、10核苷酸系列相同,外顯子3、4、5、7、9有40個(gè)核苷酸的差異[6]。由于RHD與RHCE基因在同一條染色體上,位置相距較近且方向相反,染色體若發(fā)生折疊容易出現(xiàn)交換重組和形成RHD-CE-D融合基因。DEL類(lèi)型在中國(guó)人群中以RHD 1227A和外顯子9缺失為主,因其紅細(xì)胞表面抗原密度極低,甚至達(dá)不到30個(gè)抗原表位[7],血清學(xué)試驗(yàn)容易誤定為RhD陰性。

本研究共檢測(cè)了新鄉(xiāng)市中心血站 110 667 名無(wú)償獻(xiàn)血者的Rh血型,初篩RhD陰性269例(0.24%),通過(guò)間接抗人球蛋白試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)發(fā)現(xiàn),RhD陰性256例(0.23%),與ZHANG等[8]報(bào)道的中國(guó)漢族人群中 RhD 陰性占比相似。本研究結(jié)果顯示,新鄉(xiāng)地區(qū)RhD陰性個(gè)體中,ABO血型為A型78例、B型92例、O型64例、AB型22例,Rh表型以ccdee(60.55%)和Ccdee(29.30%)居多,未發(fā)現(xiàn) CCdEe、CCdEE和CcdEE表型,與西安地區(qū)Rh表型分布基本一致[9]。本研究共檢出13例RhD變異型受試者,表型分別為CCee(2/13)、Ccee(6/13)和ccEe(5/13),進(jìn)一步證實(shí)了RHC和(或)E等位基因與RHD 基因順式串聯(lián)可抑制D蛋白的表達(dá)[10]。本研究結(jié)果顯示,7例弱D型受試者等位基因RHD*15的E6外顯子發(fā)生845G>A雜合突變,表明第9跨膜區(qū)的282位甘氨酸突變?yōu)樘於彼?從而使紅細(xì)胞表面的D抗原表位缺失。弱D15型的個(gè)體,在接受RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞時(shí)發(fā)生同種免疫產(chǎn)生抗-D抗體[11],因此,該表型個(gè)體作為受血者時(shí)應(yīng)視為Rh陰性。此外,本研究結(jié)果顯示,4例受試者的RHD基因9外顯子第 1 227 位發(fā)生G>A堿基突變,其中1例同時(shí)發(fā)生IVS7+152C>A突變,對(duì)應(yīng)的等位基因分別為RHD*01EL.01和RHD*01EL.36。RHD 1 227G>A雖為無(wú)義堿基突變,但可影響mRNA 正常拼接,使RHD基因表達(dá)正常Rh(D)蛋白的效率降低[12]。

目前,部分國(guó)家已將RHD基因檢測(cè)作為D陰性獻(xiàn)血者首次獻(xiàn)血的常規(guī)篩查方法[13]。在我國(guó),漢族RhD陰性個(gè)體攜帶DEL表型約為23.3%[14]。因此,特別是針對(duì)懷有RhD陽(yáng)性胎兒的DEL型孕婦,有必要把篩查DEL型納入常規(guī)檢測(cè),從而為臨床孕產(chǎn)婦的產(chǎn)前管理提供指導(dǎo)[15]。本研究中檢測(cè)出2例部分D型RhD變異型受試者,等位基因型為RHD*DIV.3,其產(chǎn)生原因?yàn)镽HD基因E6～E9外顯子被RHCE基因取代,從而形成RHD-CE(6-9)-RHD融合基因。與常見(jiàn)的部分D融合基因RHD-CE(3-6)-D不一致,有關(guān)該類(lèi)型的報(bào)道較少見(jiàn),可能與獻(xiàn)血者來(lái)源有關(guān),本課題組考慮追蹤該獻(xiàn)血者及其家系血型基因型,以全面分析其基因多態(tài)性。

綜上所述,新鄉(xiāng)地區(qū)RhD陰性無(wú)償獻(xiàn)血者中Rh表型分布以ccdee和Ccdee居多,RhD變異型以弱D型為主,其RHD等位基因?yàn)镽HD*15。掌握本地區(qū)Rh抗原分布特征及D變異型的等位基因類(lèi)型,為臨床開(kāi)展基因型匹配輸血治療和構(gòu)建本地區(qū)Rh血型資料庫(kù)提供依據(jù),從而保證臨床用血的安全性和有效性。