趙文璽，張晶晶，王 鵬，徐廣峰，吳德平

(1.淮安八十二醫(yī)院〔原東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院淮安醫(yī)療區(qū)〕檢驗科,江蘇 淮安 223001;2.淮安鼎衛(wèi)醫(yī)學(xué)檢驗所,江蘇 淮安 223001;3.淮安市第三人民醫(yī)院檢驗科,江蘇 淮安 223001)

食管癌是一種對人類健康有嚴重危害的惡性腫瘤,其發(fā)病率在全部腫瘤中居第8位,在腫瘤相關(guān)性死亡率排名中居第6位[1-2]。中國是食管癌高發(fā)地區(qū),每年發(fā)病人數(shù)占全球總?cè)藬?shù)50%以上[3]。食管癌是一種預(yù)后較差的惡性腫瘤[4],轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致其預(yù)后差的主要原因[5]。許多采用根治性放療的患者在1～2 a復(fù)發(fā),5 a生存率僅10%左右[6]。導(dǎo)致復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的原因較多,如腫瘤組織乏氧、對輻射效應(yīng)的個體差異、放射治療抵抗等均會導(dǎo)致病灶內(nèi)殘留有活性的癌細胞。如何提高放射治療敏感性或者降低放射治療抗性,達到預(yù)期效果,是亟待解決的問題。當(dāng)前,微RNA(microRNA,miRNA)成為研究熱點之一,其越來越多的作用和功能被研究人員發(fā)現(xiàn)。有研究表明,食管癌患者的癌組織和血液中miRNA的表達水平與健康人群有顯著差異[7]。PAN等[8]研究發(fā)現(xiàn),miR-205過表達可以提高食管癌細胞KYSE-30對放射治療的抵抗性。FEBER等[9]研究發(fā)現(xiàn),miR-205在鱗狀細胞癌和腺癌中表達較低。以上研究結(jié)果提示,癌細胞中miR-205過表達后可能會導(dǎo)致細胞對放射治療的抵抗?；诖?本研究通過建立Eca-109放射治療抵抗細胞株,檢測miR-205在放射治療前后的表達水平,同時檢測miR-205 過表達后細胞的增殖變化情況,探討miR-205與食管癌細胞Eca-109放射治療抵抗性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器人食管鱗狀細胞癌細胞株Eca-109購自上海細胞生物研究所;RPMI-l640培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司,胎牛血清購自加拿大 Wisent 公司,RNA 提取試劑盒購自德國Qiagen公司,miR-205 mimics和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司,miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng) (reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒購自美國ABI公司,細胞計數(shù)試劑盒-8 (cell counting kit-8,CCK-8)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;VARIAN 2300C/D型醫(yī)用電子直線加速器購自美國Varian Medical Systems公司,OLYMPUS CK40型倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司,KHB ST-360生物酶標儀購自上?？迫A生物工程股份有限公司,微量分光光度計購自南京五義科技有限公司,熒光定量PCR儀購自美國ABI公司,MDF-382E(CN)醫(yī)用低溫冰箱購自大連三洋冷鏈有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及放射治療抵抗模型的建立將Eca-109細胞株復(fù)蘇后接種于含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)基,置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d換液1次,待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%后擴大培養(yǎng)備用。取部分培養(yǎng)好的Eca-109細胞用直線加速器進行照射,劑量率為 200 cGy·min-1,輻射源到細胞的距離100 cm,照射面積10 cm×10 cm,照射劑量依次為 2 Gy 照射3次、3 Gy照射3次、4 Gy照射5次[10],照射時間=照射劑量/劑量率。每次射線照射后次日更換培養(yǎng)液,清除死亡細胞,傳代培養(yǎng)后至細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%再進行下一次照射,總劑量達到35 Gy后,存活下來的細胞即為放射治療抵抗細胞模型,命名為Eca-109R細胞。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染取部分培養(yǎng)的Eca-109細胞消化后稀釋為1×108L-1的單細胞懸液,每孔3 mL接種到6孔板中培養(yǎng),待細胞融合度達到50%～70%,按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作步驟,將miR-205 mimics轉(zhuǎn)染入Eca-109細胞(Eca-109 miR-205過表達細胞),繼續(xù)培養(yǎng)48 h后將細胞消化備用。

1.4 細胞形態(tài)觀察用倒置顯微鏡觀察Eca-109細胞和Eca-109R細胞貼壁生長狀態(tài)下的形態(tài)。

1.5 CCK-8法檢測細胞存活率根據(jù)照射劑量將Eca-109細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞和Eca-109R細胞分別分為0 Gy組、2 Gy組、4 Gy組、6 Gy組、8 Gy組、10 Gy組,共18組。將3種細胞消化后稀釋為2×104L-1的單細胞懸液,每孔100 μL接種到96孔板中,放置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,按照分組分別給予0、2、4、6、8、10 Gy的劑量進行照射,培養(yǎng)48 h后吸去上清液,并加入90 μL含血清培養(yǎng)液,再加入10 μL的 CCK-8試劑,之后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,使用酶標儀測定每個反應(yīng)孔在450 nm處的吸光度值,并計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(對照孔吸光度值-空白孔吸光度值)。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞增殖情況Eca-109細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞和Eca-109R 細胞的分組同“1.5”。將3種細胞消化后稀釋為1×106L-1的單細胞懸液,每孔1 mL接種到6孔板中,再補充2 mL含血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后按照分組分別給予0、2、4、6、8、10 Gy的劑量進行照射,繼續(xù)培養(yǎng)14 d,期間每3 d更換1次培養(yǎng)液,最后吸走培養(yǎng)液,甲醇固定30 min,吉姆薩染液進行染色,計數(shù)>50個細胞的克隆數(shù),并計算克隆形成率。克隆形成率=細胞克隆數(shù)/接種細胞數(shù)。

1.7 RT-PCR法檢測細胞中miR-205相對表達量采用RNA提取試劑盒提取0 Gy劑量照射的Eca-109 細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞和Eca-109R細胞中的總RNA,以及用單次4 Gy劑量照射后繼續(xù)培養(yǎng)48 h的Eca-109細胞和Eca-109R細胞中的總RNA,用微量分光光度計測定RNA濃度和純度,OD260/280處于1.8～2.0最佳,如果OD260/280<1.8,可能有蛋白質(zhì)污染;OD260/280>2.0,可能有試劑殘存。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,以提取到的RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄出互補的單鏈DNA,以U6為內(nèi)參基因,應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測miR-205的Ct值,采用2-ΔΔCt法計算miR-205的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 Eca-109細胞和Eca-109R細胞的形態(tài)結(jié)果見圖1。Eca-109細胞形態(tài)均一,大小一致,大多呈片狀或梭狀,折光性良好;Eca-109R細胞出現(xiàn)少量多角形細胞,伴有顆粒感,折光性差。異常形態(tài)的細胞在后續(xù)傳代培養(yǎng)過程中逐漸消失,最終獲得均一性良好的細胞株Eca-109R。

圖1 Eca-109和Eca-109R細胞的形態(tài) (×100)Fig.1 Morphology of Eca-109 and Eca-109R cells (×100)

2.2 Eca-109細胞、Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞存活率比較結(jié)果見表1。在0 Gy組,Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞與Eca-109細胞的存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在2、4、6 Gy組,Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞的存活率顯著高于Eca-109細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在8 Gy組,Eca-109R細胞的存活率顯著高于Eca-109細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Eca-109 miR-205過表達細胞與Eca-109細胞的存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在10 Gy組,Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞與Eca-109細胞的存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。

表1 Eca-109細胞、Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞存活率比較Tab.1 Comparison of cell survival rates among Eca-109 cells,Eca-109R cells and Eca-109 miR-205 overexpression cells

2.3 Eca-109細胞、Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞增殖能力比較結(jié)果見表2和圖2。在0 Gy 組,Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞與Eca-109細胞的增殖能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。在2、4、6 Gy組,Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞的增殖能力顯著高于Eca-109細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在8 Gy 組,Eca-109R細胞的增殖能力顯著高于Eca-109細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Eca-109 miR-205 過表達細胞與Eca-109細胞的增殖能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在10 Gy組,Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞與Eca-109細胞的增殖能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。

表2 Eca-109細胞、Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞增殖能力比較Tab.2 Comparison of cell proliferation ability among Eca-109 cells,Eca-109R cells and Eca-109 miR-205 overexpression cells

2.4 Eca-109細胞、Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞中miR-205相對表達量比較在0 Gy組,Eca-109細胞、Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞中miR-205的相對表達量分別為0.73±0.04、1.24±0.06、3.91±0.22,Eca-109R細胞、Eca-109 miR-205過表達細胞中miR-205的相對表達量顯著高于Eca-109細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在4 Gy組,Eca-109細胞、Eca-109R細胞中miR-205的相對表達量分別為1.33±0.04、3.26±0.06,Eca-109R細胞中miR-205的相對表達量顯著高于Eca-109細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4 Gy組的Eca-109細胞中miR-205的相對表達量顯著高于0 Gy組的Eca-109細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);4 Gy組的Eca-109R細胞中miR-205的相對表達量顯著高于0 Gy組的Eca-109R細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

在中國,食管癌的發(fā)病率居高不下,近年來隨著人們健康意識的提升和醫(yī)療技術(shù)的進步,越來越多的食管癌患者被確診,其中超過90%的患者為食管鱗狀細胞癌,而歐美地區(qū)的食管癌以腺癌為主[11]。因此,需要建立符合我國食管癌特征的診療流程,制定有效可行的治療方案和預(yù)后評估手段,不斷深入探索食管鱗狀細胞癌的病因、病程,為該病的檢測、診斷和治療提供更充分的依據(jù)。當(dāng)前,食管癌的治療以手術(shù)為主,由于各種原因無法進行手術(shù)的患者會選擇放射治療和化學(xué)治療,隨著放射治療技術(shù)的精進,食管癌患者放射治療后5 a生存率也從最初的低于20%提高到44%左右。但是較高的復(fù)發(fā)率依然困擾著醫(yī)生和患者[12],復(fù)發(fā)的主要原因是癌組織范圍難以精準測定,使放射治療劑量的設(shè)定難度加大,以及癌細胞對放射治療的抵抗性等。對此,多數(shù)學(xué)者選擇使用惡性程度更高的低分化食管癌細胞株來建立放射治療抵抗模型[13-14];但也有研究表明,無論食管癌分化程度高低,都存在放射治療抵抗的現(xiàn)象[9]。本研究在查閱大量文獻,并進行預(yù)實驗驗證后,最終選擇高分化細胞株Eca-109進行造模,該細胞株來源于人食管鱗狀細胞癌,細胞特征明顯,易于傳代培養(yǎng)。本研究采用多次分階段遞增劑量照射的方法建立放射治療抵抗模型,結(jié)果顯示,造模完成后,常規(guī)培養(yǎng)條件下,Eca-109R細胞的形態(tài)特征與Eca-109細胞無明顯區(qū)別,可以正常傳代、貼壁生長。在給予Eca-109、Eca-109R細胞相同劑量射線照射后,Eca-109R細胞的存活率顯著高于Eca-109細胞,細胞增殖能力也顯著高于Eca-109細胞,與陳鑫等[15]的研究結(jié)果一致。

miRNA 是存在于真核生物體內(nèi)的一類長度不超過25個核苷酸的非編碼RNA,在機體內(nèi)幾乎所有的代謝活動和疾病過程都有miRNA的參與[16]。王智[17]研究發(fā)現(xiàn),血清中miRNA水平的改變可以預(yù)測化學(xué)治療的效果和預(yù)后情況。也有研究表明,在非小細胞肺癌中沉默miR-205后,可以抑制腫瘤細胞的增殖及體外血管的形成[18]。miR-205的主要功能是調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲及凋亡,但是其在不同的腫瘤組織或細胞中的表達水平卻不盡相同。有研究證實,miR-205參與腫瘤細胞增殖和凋亡的過程[8]。本研究對比了miR-205在Eca-109R與Eca-109細胞中的表達水平,以及在接受射線照射后miR-205的表達水平變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-205 在Eca-109R細胞中的相對表達量顯著高于Eca-109細胞,且細胞的存活率和克隆形成率也高于Eca-109細胞,說明細胞的存活和增殖能力的提高與miR-205高表達有關(guān),miR-205可能參與了細胞的放射治療抵抗。本研究還發(fā)現(xiàn),Eca-109 miR-205 過表達細胞的存活率和克隆形成率均顯著高于Eca-109細胞,進一步說明miR-205可以提高Eca-109細胞的增殖能力,達到抵抗射線照射的作用,與細胞的放射治療抵抗有關(guān),從而推測可以通過抑制miR-205的表達水平來降低Eca-109R細胞的放射治療抗性。

綜上所述,本研究通過建立放射治療抵抗細胞模型,證實了miR-205與人食管鱗狀細胞癌細胞株Eca-109的放射治療抗性有相關(guān)性,為下一步驗證調(diào)節(jié)miR-205表達水平來改變Eca-109和Eca-109R細胞的放射治療抗性提供了依據(jù),為食管癌放射治療方法的改進和優(yōu)化提供了新的理論依據(jù)。