摘要 為了解引起富平尖柿炭疽病的病原菌種類及其生物學(xué)特性，本試驗(yàn)采集發(fā)生炭疽病的柿樹(shù)秋梢，按照稀釋分離法分離病原菌，觀察其形態(tài)學(xué)特征，利用真菌通用引物（ITS1/ITS4）和膠孢炭疽菌特異性引物（Cg Int/ITS4）進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)生物學(xué)特性研究，以及通過(guò)有傷接種試驗(yàn)確定病原菌致病性。結(jié)果表明，引起富平尖柿炭疽病的病原菌為刺盤(pán)孢屬（Colletotrichum）哈銳炭疽菌（Colletotrichum horii）；哈銳炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)最適溫度為25 ℃左右；該病原菌對(duì)富平尖柿致病力強(qiáng)，適宜溫度濕度極易引起炭疽病。

關(guān)鍵詞 柿樹(shù)；病原鑒定；哈銳炭疽菌；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S436.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）23-24-0128-04

陜西富平柿子栽植歷史悠久，目前柿子種植面積達(dá)24 000 hm2，掛果面積達(dá)12 000 hm2，年產(chǎn)鮮柿2.8×108 kg，加工柿餅7×107 kg，全產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值約65億元。富平柿餅因個(gè)大、底亮、霜白、質(zhì)潤(rùn)和味香甜的品質(zhì)，其市場(chǎng)占有率和知名度不斷提升，柿子產(chǎn)業(yè)已發(fā)展成為當(dāng)?shù)氐奶厣еa(chǎn)業(yè)。富平尖柿是柿炭疽病菌的易感品種[1-2]，尤其是5年以下樹(shù)齡，若管理不當(dāng)，柿園發(fā)病率可達(dá)70%，嚴(yán)重時(shí)甚至毀園[3-4]。

柿樹(shù)炭疽病病原菌有著豐富的形態(tài)學(xué)特征，在不同的環(huán)境條件下其表型存在一定的差異，因此單純的形態(tài)學(xué)鑒定無(wú)法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[5]。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，目前已鑒定出能夠侵染柿樹(shù)的炭疽菌有膠孢炭疽復(fù)合種（Colletotrichum gloeosporioides species complex）中的膠胞炭疽菌（C. gloeosporioides）、哈銳炭疽菌（C. horii）和暹羅炭疽菌（C. siamense）[6]，尖孢炭疽復(fù)合種（C. acutatum species complex）中的尖孢炭疽菌（C. acutatum）[7]，以及博寧炭疽復(fù)合種（C. boninense species complex）中的喀斯特炭疽菌（C. Karstii）[8-9]。國(guó)內(nèi)報(bào)道的柿樹(shù)炭疽菌種類主要為膠孢炭疽復(fù)合種中的膠胞炭疽菌和哈銳炭疽菌[10-13]。從病原菌的形態(tài)特征上，張敬澤等[14]認(rèn)為柿炭疽病菌為膠胞炭疽菌，但根據(jù)ITS、EFla和GPDH基因序列，Weir 等[15]則認(rèn)為是哈銳炭疽菌。目前富平尖柿炭疽菌在分子生物學(xué)方面尚未進(jìn)行相關(guān)鑒定，無(wú)法確定其具體種類。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)富平尖柿炭疽病病原菌進(jìn)行分離，運(yùn)用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)進(jìn)行菌種鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性以及致病性進(jìn)行探究，為富平尖柿炭疽病病原診斷和病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

樣品采集于富平縣某村發(fā)生炭疽病的柿樹(shù)秋梢。

1.2 儀器與試劑

超凈工作臺(tái)（上海力辰科技）、移液器（德國(guó)Eppendorf）、測(cè)序儀及PCR儀（Applied Biosystems）、DNA電泳槽（北京六一儀器廠）、穩(wěn)壓電泳儀（北京六一儀器廠）、電熱恒溫水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、凝膠成像儀（上海復(fù)日科技儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱及恒溫?fù)u床（太倉(cāng)市科教器材廠）和Surf系列精密單道可調(diào)移液器（上海生工生物股份有限公司）。

Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖BBI、SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒和DNA Ladder Mix maker均由上海生工生物股份有限公司提供。

1.3 病原菌分離純化

于2022年10月采炭疽病秋梢，參照方中達(dá)[16]的方法進(jìn)行病原菌的分離純化。（1）選取發(fā)病新梢，用消毒剪刀剪取發(fā)病段，放入滅菌空培養(yǎng)皿中，無(wú)菌水清洗表面，用75%乙醇消毒2次，無(wú)菌水清洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干組織表面水分。（2）用消毒剪刀剪開(kāi)發(fā)病組織表層，取內(nèi)部黑色發(fā)病組織置于PDA培養(yǎng)基中，黑暗條件下26 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，待組織塊在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌絲后，用無(wú)菌接種針挑取菌絲進(jìn)行分離培養(yǎng)。（3）用無(wú)菌水稀釋長(zhǎng)有分生孢子的菌體，再經(jīng)滅菌脫脂棉過(guò)濾，濾液用無(wú)菌水梯度稀釋后涂布，然后挑取單菌落，在PDA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。（4）重復(fù)步驟（3）3次，獲得的純菌株，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 形態(tài)學(xué)鑒定

將純化后的菌株接入PDA培養(yǎng)基中，置于26 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)5 d，觀察菌落顏色和形態(tài)，取少量菌體于顯微鏡下觀察分生孢子器、分生孢子及附著胞形態(tài)，通過(guò)查閱《真菌鑒定手冊(cè)》和《植物病原真菌》進(jìn)行初步鑒定[17]。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

病原菌總DNA提取按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒操作說(shuō)明。使用病原菌鑒定引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，以保證獲得全長(zhǎng)產(chǎn)物。1％瓊脂糖電泳，150 V、電泳20 min，觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物電泳條帶切取所需 DNA目標(biāo)條帶，純化后由上海生工生物股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序得到的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)。

1.6 生物學(xué)測(cè)定

1.6.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 "將直徑為6 mm的菌餅接種到 PDA平板中央，分別于5、10、15、20、25、28、30和35 ℃下培養(yǎng)5 d，每個(gè)處理重復(fù)3次，測(cè)量菌落直徑。

1.6.2 溫度對(duì)孢子萌發(fā)的影響 "將直徑為6 mm的菌餅接種到PDA平板中央，25 ℃下培養(yǎng)7 d，刮去菌體，添加滅菌水，用滅菌紗布過(guò)濾，制備孢子懸液，吸取100 μL孢子懸液于制好的PDA平板上，均勻涂布，每個(gè)處理重復(fù)3次，觀察孢子是否萌發(fā)以及萌發(fā)所需時(shí)間。

1.7 致病性測(cè)定

將純化培養(yǎng)5 d的菌株菌落，配制成105個(gè)/mL的孢子懸浮液。采集的新鮮柿樹(shù)枝條、葉片和果實(shí)用1.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒4～5 min，無(wú)菌水沖洗3次，并置于超凈工作臺(tái)吹干。枝條、葉片和果實(shí)分別進(jìn)行有傷接種，重復(fù)3次，無(wú)菌水接種作為對(duì)照，黑暗條件下26 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。從發(fā)病部位重新分離病原菌，通過(guò)觀察菌落及分生孢子形態(tài)特征，與原接種菌株進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，菌株菌落近圓形，初期為白色，氣生菌絲絨毛狀，隨著菌齡增長(zhǎng)，菌落出現(xiàn)同心輪紋，顏色逐漸變深呈灰褐色，背面有少量黑色素沉淀，呈灰黑色到深褐色，見(jiàn)圖1。分生孢子長(zhǎng)橢圓形或圓柱形，表面光滑，兩端鈍圓，單孢無(wú)色。通過(guò)查閱《真菌鑒定手冊(cè)》和《植物病原真菌》進(jìn)行初步鑒定為刺盤(pán)孢屬真菌。

2.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)真菌通用引物（ITS1/ITS4）[18]，擴(kuò)增出富平尖柿炭疽病菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，大小549 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜見(jiàn)圖2。另外，利用膠孢炭疽菌特異性引物（Cg Int/ITS4）[19]未擴(kuò)增出目標(biāo)序列。將測(cè)序后的ITS序列通過(guò)NCBI比對(duì)，結(jié)果顯示該菌株DNA序列與哈銳炭疽菌（登錄號(hào)：MN635649.1）的核苷酸序列同源性為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將供試菌株鑒定為哈銳炭疽菌。

2.3 病原菌生物學(xué)鑒定

2.3.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 "由圖3可看出，適宜富平尖柿炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍是15～25 ℃，菌落平均日增速度在15～25 ℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高而增加，15～20 ℃時(shí)日生長(zhǎng)速度增加較快，20～25 ℃時(shí)日生長(zhǎng)速度變緩，菌落在25 ℃條件下生長(zhǎng)最快；當(dāng)溫度超過(guò)25 ℃時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度迅速下降。通過(guò)測(cè)定不同溫度下菌落日增速度，表明該病原菌最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃左右，低于5 ℃或高于35 ℃，菌絲均不能正常生長(zhǎng)。

2.3.2 溫度對(duì)孢子萌發(fā)的影響 "顯微鏡和肉眼觀察結(jié)果表明，孢子萌發(fā)的溫度范圍是10～30 ℃，最適孢子萌發(fā)溫度為25 ℃左右（表2）。

2.4 致病性鑒定

有傷接種的枝條、葉片和果實(shí)均呈現(xiàn)出黑褐色小斑點(diǎn)（圖3），取發(fā)病組織進(jìn)一步分離病原菌進(jìn)行培養(yǎng)，均得到與原接種菌株性狀一致的培養(yǎng)物。

3 結(jié)論與討論

炭疽菌屬真菌種類繁多，且其形態(tài)特征易受培養(yǎng)條件影響，因此單純采用形態(tài)學(xué)進(jìn)行種間鑒定較困難[20]，目前多采用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定。國(guó)內(nèi)報(bào)道的柿樹(shù)炭疽菌種類主要為膠孢炭疽復(fù)合種中的膠胞炭疽菌（C. gloeosporioides）和哈銳炭疽菌（C. horii），本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及利用真菌通用引物（ITS1/ITS4）和膠孢炭疽菌特異性引物（CgInt/ITS4）的分子鑒定，以及回接試驗(yàn)確定致病性，鑒定出引起富平尖柿炭疽病的病原菌為哈銳炭疽菌（C. horii）。富平尖柿炭疽病菌菌絲在10～35 ℃均可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃左右；病菌孢子在10～30 ℃均可萌發(fā)，最適孢子萌發(fā)溫度為25 ℃左右。這也符合柿樹(shù)炭疽病在大田夏、秋兩季溫度適宜，一旦雨水充足，就極易在尖柿樹(shù)上發(fā)生的特點(diǎn)。

綜上，富平尖柿屬于炭疽病菌的易感品種，該病對(duì)富平地區(qū)尖柿產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成了一定影響，對(duì)病害的診斷及病原菌的鑒定是進(jìn)行病害防治的前提。下一步，將通過(guò)室內(nèi)和田間試驗(yàn)，篩選出對(duì)富平尖柿炭疽病有良好防治效果的藥劑，為尖柿樹(shù)的炭疽病防治提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 馮鎖牢，穆娟. 富平尖柿炭疽病綜合防治技術(shù)[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，55（6）：244-245.

[2] 黨立勝，陳聯(lián)英，潘高峰. 富平大尖柿炭疽病的發(fā)生與防治技術(shù)試驗(yàn)報(bào)告[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，64（1）：11-13.

[3] 穆娟. 富平縣柿子產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展思路[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，58（4）：188-189.

[4] 路雅斌，程占國(guó)，康克功. 富平柿子炭疽病調(diào)查研究[J]. 陜西林業(yè)科技，2015（2）：98-100.

[5] HYDE K D，CAI L，CANNON P F，et al. Colletotrichum-names in current use[J]. Fungal diversity，2009，39：147-182.

[6] CHANG T，HASSAN O，JEON J Y，et al. First report of anthracnose of persimmon （Diospyros kaki L. f.） caused by Colletotrichum siamense in Korea[J]. Plant disease，2018，102（2）：443.

[7] WILLIAMSON S M，SUTTON T B. First report of anthracnose caused by Colletotrichum acutatum on persimmon fruit in the United States[J]. Plant disease，2010，94（5）：634.

[8] WANG J，AI C X，YU X M，et al. First report of Colletotrichum karstii causing anthracnose on persimmon leaves in China[J]. Plant disease，2016，100（2）：532-538

[9] 張童，姚立萍，胡玉慈，等. 甜柿炭疽病病原菌的鑒定及其防治藥劑的篩選[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，49（5）：589-596.

[10] 張敬澤，徐同，何黎平. 浙江無(wú)核柿炭疽病菌鑒定及附著胞形成過(guò)程中的核相變化[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2005，24（3）：446-456.

[11] 李明江. 膠孢炭疽菌侵染柿樹(shù)的細(xì)胞學(xué)研究及CGTA1基因的克隆[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2007.

[12] 張敬澤. 柿樹(shù)炭疽病病原菌及其侵染機(jī)制研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2005.

[13] 謝柳. 哈銳炭疽菌的分類和侵染特征的研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2010.

[14] 張敬澤，徐同. 柿樹(shù)炭疽病菌在越冬枝條上的菌態(tài)及數(shù)量[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2003，30（4）：437-438.

[15] WEIR B S，JOHNSTON P R. Characterisation and neotypification of Gloeosporium kaki hori as Colletotrichum horii nom. nov[J]. Mycotaxon，2010，111（1）：209-219.

[16] 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 3版. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[17] 王雪菲，李金榮，盧東曉，等. 核桃炭疽病病原菌的分離鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2020，47（5）：1161-1162.

[18] WEIR B S，JOHNSTON P R，DAMM U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in mycology，2012，73（1）：115-180.

[19] MILLS P R，SREENIVASAPRASAD S，BROWN A E. Detection and differentiation of Colletotrichum gloeosporioides isolates using PCR[J]. FEMS microbiology letters，1992，98（1/2/3）：137-143.

[20] HYDE K D，CAi L，MCKENZIE E H C，et al. Colletotrichum：a catalogue of confusion[J]. Fungal diversity，2009，39（1）：1-17.

（責(zé)編：何 艷）