摘 要：【目的】探究歐李Dof（DNA-binding with one zinc finger）鋅指蛋白在非生物脅迫條件下的功能，為ChDof 基因的研究與利用奠定基礎。【方法】基于歐李全基因組和轉錄組數據對Dof 基因家族進行鑒定，并利用實時定量PCR 分析Dof 基因在非生物脅迫下的表達情況?！窘Y果】歐李共有23 個Dof 基因家族成員，其編碼區(qū)CDS 序列長度為226 ～ 515 bp，相對分子質量為24 227.52 ～ 55 368.21，理論等電點為4.78 ～ 9.36，且其在歐李的8 條染色體上都有分布。在構建歐李和擬南芥的系統(tǒng)進化樹中發(fā)現，歐李共分為9 個亞組，同一亞族成員中的基因結構和蛋白保守基序均具有較高的相似性，且歐李Dof 基因家族成員主要分布在D1 亞組中。在對其亞細胞定位時發(fā)現，絕大多數ChDof 基因主要分布于細胞核中。對歐李Dof 家族成員啟動子區(qū)域順式調控元件的預測結果表明，其啟動子區(qū)存在著至少1 個激素調節(jié)及逆境脅迫反應元件。qRT-PCR 分析結果表明，絕大多數的ChDof 基因在鹽、高溫和低溫脅迫下的表達量均上調，而ChDof11、ChDof12、ChDof17 基因在鹽、滲透（PEG）、高溫和低溫4 種脅迫下的表達量均上升，ChDof03 基因對高鹽脅迫的反應最敏感，ChDof01 基因對低溫脅迫的響應最敏感，ChDof11 基因在滲透、高溫和低溫脅迫下的表達量均有極顯著的提高，而ChDof7和ChDof08 基因在4 種脅迫誘導下的表達量均降低?！窘Y論】共鑒定出23 個Dof 家族成員，歐李ChDof11、ChDof12、ChDof17 這3 個基因在逆境脅迫中均有控制功能，ChDof7 和ChDof08 這2 個基因則在逆境脅迫中均起負調節(jié)作用。Dof 基因在歐李對逆境脅迫的響應中發(fā)揮著重要作用。

關鍵詞：歐李；Dof；基因家族分析；非生物脅迫；基因表達

中圖分類號：S662.3 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）01—0143—11

歐李Cerasus humilis（Bge）Sok 屬薔薇科櫻桃屬，是我國特有的一種果、藥、牧兼用的植物資源。歐李樹體矮小呈灌木狀，具有抗旱、抗寒、耐瘠薄等特性，為干旱、半干旱丘陵地區(qū)營造生態(tài)經濟林的首選樹種[1-2]。歐李的果實、莖葉、種仁中均含有豐富的蘋果酸、類黃酮、不飽和脂肪酸、堿性多糖等多種生物活性物質，具有較高的開發(fā)利用和研究價值[3]。

DNA 結合單鋅指（DNA binding with one zincfinger，Dof）蛋白屬于C2-C2 單鋅指蛋白超家族，含有一種特殊的Cys 殘基，因此被稱作Dof 結構域[4]。Dof 蛋白一般包含200 ～ 400 個堿基，僅包含1 個復制的Dof 保守區(qū)和2 個具有高度保守的DNA 鍵和C 端的轉錄區(qū)[5]。Dof 蛋白為植物體內特有的一類反式作用因子，在植株生長調控、信號傳導、種子萌發(fā)、光周期響應、非生物脅迫和開花調控中均發(fā)揮著重要作用[6-8]。ZmDof1 是玉米Dof 家族的第1 個成員，主要通過激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因啟動子來調節(jié)C4 植物的光合作用[9]。DAG1 和DAG2 是擬南芥中的一類Dof 轉錄因子，可調控種子萌發(fā)相關基因的表達[10]，此外，OBP1 可控制擬南芥防御基因的表達[11]。毛竹中的大部分PheDofs 基因都參與了干旱、低溫和高鹽的響應過程[12]。在番茄的光周期反應中，SlCDF1和SlCDF3 基因在光周期開始時的表達量均最高；而SlCDF2、SlCDF4 和SlCDF5 的表達量均在夜間達到峰值[13]。

目前，Dof 基因轉錄因子的研究對象多為模式植物和多年生植物（如擬南芥[14]、番茄[13]、核桃[15]、水稻[14] 和玉米[9] 等），而對歐李Dof 基因的研究尚未見諸報道。為給歐李ChDof 基因的研究與利用奠定基礎，以歐李品種‘晉歐1 號’的幼苗為研究對象，對其ChDof 基因進行全基因組鑒定，研究其結構特點、染色體定位、啟動子作用元件及編碼蛋白的理化性質，同時分析其在鹽脅迫、滲透脅迫、高溫脅迫和低溫脅迫的葉片中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 歐李Dof 基因家族成員的鑒定及其蛋白理化性質的分析

研究所需的歐李Cerasus humilis（Bge.）Sok.全基因組序列由山西農業(yè)大學園藝學院歐李課題組提供。首先，構建BLAST 本地數據庫，從Gramene（http：//www.gramene.org/） 網站中選擇桃的Dof 序列，然后，從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數據庫中獲取Dof 家族的隱馬爾可夫模型文件（PF02701）；再從Pfam 數據庫和轉錄組數據庫中獲得相似的Dof 基因序列，利用軟件MAGA7.0進行比對，將冗余的序列去除后，最終獲得23 個Dof 基因。利用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析該家族成員的理化性質，得到已知序列的歐李Dof 基因家族成員的基因編號、氨基酸長度、等電點、分子質量等數據。蛋白的亞細胞定位則是通過lant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plantmulti/）獲得的。

1.2 歐李Dof 基因系統(tǒng)進化樹的構建、基因結構圖的繪制、保守基序的分析

參照有關文獻[14] 中說明的擬南芥Dof 基因編號， 從TAIR 數據庫（https：//www.arabidopsis.org/）中得到36 個擬南芥Dof 家族成員的氨基酸序列，利用MEGA7.0 軟件將鑒定到的ChDof 和AtDof 保守結構域序列進行多序列比對，最終利用近鄰法（NeighborJoining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹（bootstrap=1 000）。參考擬南芥Dof 基因家族的分類方法，將歐李Dof 基因家族劃分為9 個亞組（A、B1、B2、C1、C2.1、C2.2、C3、D1、D2）。使用MEME（https：//meme-suite.org/meme/） 在線軟件分析得到ChDof 的保守基序，將預測基序數量設定為10，然后利用TBtools 軟件根據基因注釋結果繪制基因結構圖。

1.3 ChDof 基因家族成員染色體的定位和共線性及順勢作用元件的分析

將所有的ChDof 基因組的物理位置信息整理好后，使用TBtools 軟件進行可視化操作，從而確定ChDof 基因家族成員所在的染色體位置。在默認參數下，使用MCscanX 軟件對ChDof 基因家族成員中大片段串聯重復事件進行分析，以家族成員具體的染色體位置信息為依據，利用TBtools 軟件進行歐李Dof 基因染色體位置示意圖繪制以及歐李基因組內共線性分析。制作基因染色體的定位與共線性圖譜。

利用TBtools 軟件提取歐李Dof 基因5′ 端上游2 000 bp 的基因序列作為啟動子區(qū)，使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）網站對所得結果進行順式作用元件分析，最后用TBtools 工具繪制圖譜。

1.4 4 種脅迫處理與實時熒光定量PCR 分析

供試的歐李品種為‘晉歐1 號’，選取苗齡為2 個月的長勢一致的歐李扦插苗移栽至裝有1/2 霍格蘭營養(yǎng)液的塑料盒（348 mm×247 mm×94 mm）中水培[16]，分別用20% 的PEG6000、200 mmol/L的NaCl[17]，并分別于4 ℃的低溫和30 ℃的高溫條件下脅迫處理水培苗，對照處理的則用1/2 的霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)。然后分別于脅迫處理后的0、6、12、24、48 h 取樣，并將處理后各個時間點采集的葉片樣品和對照處理的葉片樣品迅速放入液氮中并保存于-80 ℃的冰箱中。每個處理各設置3 次生物學重復，以15 株幼苗為1 次重復。

用CTAB 法提取葉片樣品的總RNA，然后用凝膠電泳檢測其RNA 質量，接著使用核酸蛋白儀（Thermo ND2000C）進一步確定RNA 的質量和濃度， 最后用TaKaRa [PrimeScript ? RT reagentKit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）] 反轉錄試劑盒將合格的RNA 反轉錄成cDNA。利用Vector NTI 軟件設計qRT-PCR 引物， 將引物送至西安擎科生物科技有限公司進行合成，引物信息見表1。以RPL-13 為內參基因，利用SYBRGreen（TaKaRa）試劑盒在Q3 實時熒光定量PCR儀上進行檢測，各步反應均參照SYBR Green 說明書進行。采用2-ΔCt 法以熒光定量分析結果計算相對表達量[18]，使用SAS 9.2 軟件分析其差異顯著性，利用Duncan’s 法檢驗差異顯著性（P ＜ 0.05）。

用Origin 2019 軟件繪制相對表達量的柱狀圖，以便進一步分析其表達模式。

2 結果與分析

2.1 ChDof 基因家族成員理化性質

利用BLAST 數據庫比較，以Hmmer 3.0 軟件搜索，共鑒定出23 個歐李Dof 基因。為了更加方便地查找歐李Dof 基因，采用歐李名稱的縮寫加上基因所在染色體編號自上而下（即從基因ChDof01到ChDof23） 進行命名，23 個歐李Dof 基因家族成員的理化性質見表2。由表2 可知，23 個歐李Dof 基因編碼的氨基酸長度為226 ～ 515 bp；其中，基因ChDof10 的氨基酸長度最小，編碼226 個氨基酸；基因ChDof1 的氨基酸長度最大，編碼515 個氨基酸。23 個歐李Dof 基因的相對分子質量為24 227.52 ～ 55 368.21，與其編碼的氨基酸長度呈正相關。23 個歐李Dof 基因的等電點都不相同；ChDof19、ChDof21、ChDof01、ChDof02、ChDof11、ChDof16、ChDof23、ChDof03 的等電點均小于7，這8 個基因均編碼酸性氨基酸序列，其余均編碼堿性氨基酸序列；其中，基因ChDof19的等電點（4.78）最低，基因ChDof04 的等電點（9.36）最高。歐李Dof 基因家族的亞細胞定位預測結果顯示，所有家族成員全部位于細胞核中。歐李Dof 基因家族的不穩(wěn)定系數為42.07 ～ 67.89，均大于40，說明其所有的家族成員均為不穩(wěn)定蛋白，歐李Dof 基因家族編碼的所有蛋白的親水性均為負值，即所有蛋白都為親水蛋白。

2.2 ChDof 基因家族系統(tǒng)進化樹分析

利用鄰接法，以在TAIR 網站（https：//www.arabidopsis.org/）中獲得的擬南芥Dof 蛋白序列（36 個）與歐李Dof 蛋白序列（23 個）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用MAGA 7.0 軟件構圖，以歐李和擬南芥的Dof 基因家族成員構建基因樹，最終得到的系統(tǒng)進化樹如圖1 所示。由圖1 可知，歐李ChDof基因被分為4 個群、9 個亞組。其大部分ChDof基因存在于D1 亞組中，且只有C3 亞組中不包含歐李基因，目前的研究中并未發(fā)現C3 亞組中擬南芥Dof 基因（AT4G21080.1、AT4G21040.1、AT4G21050.1 和AT4G21030.1）的特定功能，因此推測，Dof 基因在不同的生物物種中可能存在著進化方面的差異。

2.3 ChDof 基因家族的基因結構和保守基序分析

利用在線軟件MEME 分析ChDof 基因的保守基序，利用TBtools 工具繪制基因結構圖，可以得到基因結構和保守基序圖譜（圖2），通過比對可以發(fā)現，同類基因的結構較為相似。由圖2 可知，Motif1 存在于所有蛋白中，是歐李Dof 基因中保守性較強的保守基序。與其他亞家族相比，D1 亞組含有更多的內含子，屬于內含子富集類，D1 亞組中的ChDof01、ChDof03、ChDof04 和ChDof11這4 個基因均包含10 個motif，且其基因結構相似。

由此推斷，親緣關系密切的ChDof 家族基因成員，無論是基因結構還是保守基序都更加相似。保守基序分析結果顯示，16 個ChDof 蛋白缺乏高度相似性。然而，D1 亞家族的成員有3 個保守的基團特異性區(qū)域，即基序2、4 和9。在各家族的進化關系中，大部分密切相關的基因均由相似的保守基序組成，表明Dof 家族在功能上存在相似性。

2.4 歐李Dof 基因家族共線性及染色體定位分析

為了更加直觀地了解歐李8 條染色體上Dof基因的分布情況，同時為了方便于在染色體水平上研究歐李Dof 基因，利用TBtools 工具，根據基因注釋信息，對歐李Dof 基因進行了定位分析，結果如圖3 所示。ChDof 基因在歐李染色體上呈現出無規(guī)則的分布狀態(tài)，且在所有染色體上均有分布，其在2、5、8 號染色體上各分布4 個成員，在7 號染色體上分布的成員最少，只有ChDof19這1 個家族成員。物種間共線性分析，主要根據多個物種之間所有同源基因的位置，比較基因結構和基因序列的差異，從而確定多個物種之間的進化關系。有關研究者通常認為，在同一條染色體上，在200 kb 的范圍內，彼此相似度超過70% 的基因，被認為存在串聯重復事件。串聯重復基因是基因家族擴增的主要方式之一[15]。用MCScanX 軟件分析了歐李共線性和基因重復事件，由圖3 可知，歐李Dof 基因家族中存在7 對具有共線性的基因（ChDof01 與ChDof11、ChDof01與ChDof21、ChDof05 與ChDof13、ChDof11 與ChDof21、ChDof15 與ChDof12、ChDof12 與ChDof20、ChDof15 與ChDof20），這種現象可能是由染色體大片段的復制引起的。進一步分析后發(fā)現，8 號染色體（Chr8）和5 號染色體（Chr5）都有4 對串聯重復基因（圖3）。這些分析結果都表明，在歐李Dof 基因的進化中，染色體復制和基因重復事件可能都發(fā)揮了重要作用。

2.5 歐李Dof 家族成員啟動子順式調控元件分析

對歐李Dof 基因家族啟動子序列的分析結果表明，Dof 啟動子中含有的順式調控元件種類具有一定的相似性，例如所有的家族成員中均含有光響應元件，且在絕大多數成員中其含量均最豐富。大多數ChDof 基因的啟動子中都存在38% 的光響應元件（包括ACE、G-Box、3-AF1 binding site、GT1-motif 等）；有38% 的啟動子屬于植物激素響應元件（包括TGA-element、TATC-box、ABRE 等）；部分ChDof 基因的啟動子中含有15% 的脅迫響應元件和8% 的與生長發(fā)育相關的順式元件。因此認為，Dof 基因參與了光響應、激素響應、脅迫響應和植物的生長發(fā)育，這與目前的研究結果[20] 相一致。此外，已知ABA 和非生物脅迫有著密切關系，除了ChDof04、ChDof05、ChDof10、ChDof12這4 個基因外，歐李Dof 基因家族啟動子均含有ABRE 響應元件，這一分析結果為下一步抗逆基因的篩選提供了思路。

2.6 歐李Dof 家族基因實時熒光定量分析

以ChDof 家族成員的順式作用元件和轉錄組數據為依據，從歐李Dof 基因家族中共篩選出12 個ChDof 基因，利用qRT-PCR 技術探究其在鹽（200 mM/L Nacl）脅迫、滲透（20%的PEG6000）脅迫、高溫（30 ℃）脅迫和低溫（4 ℃）脅迫下表達量的變化趨勢。歐李部分Dof 家族成員在4 種非生物脅迫下的表達模式如圖5 所示。由圖5 可知，基因ChDof11、ChDof12、ChDof17 在4 種脅迫處理下的表達量總體上均呈上調趨勢，據此推測，這3 個基因可能和植物的抗逆性有關；而ChDof07和ChDof08 這2 個基因在4 種脅迫處理下的表達量有不同程度的下調趨勢，據此推測，這2 個基因在植物逆境脅迫中均起著負調節(jié)作用。

在鹽脅迫處理下，ChDof07、ChDof08、ChDof20、ChDof21、ChDof22 這5 個基因的表達量總體都呈波動式下降趨勢，而其他基因經過鹽脅迫處理后其表達量總體上均呈上升趨勢（圖5A）。其中，基因ChDof03、ChDof11 的表達量均明顯提高，說明鹽脅迫可以促進其表達；而基因ChDof03不僅在鹽脅迫中有較高的表達量，而且在鹽脅迫處理48 h 的表達量最高，為對照的3.8 倍，據此推測，基因ChDof03 在應答鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

在滲透脅迫下，ChDof06、ChDof09、ChDof11、ChDof12、ChDof17、ChDof22 這6 個基因的表達量總體均呈上調趨勢，而其余基因的表達量均呈下調趨勢（ 圖5B）。其中，ChDof09 在脅迫48 h 的表達量極顯著上升，是對照的10.9 倍；基因ChDof11 的表達量則隨著脅迫時間的增加而呈穩(wěn)步上升的變化趨勢，表明該基因在滲透脅迫下仍能穩(wěn)定表達。

在高溫脅迫下， 只有基因ChDof01、ChDof03、ChDof07、ChDof08 的表達量均下調， 而絕大多數ChDof 基因的表達量均上調（圖5C），表明歐李Dof 基因對高溫脅迫的反應較為敏感。ChDof11 和ChDof22 這2 個基因的表達量分別在高溫脅迫24 和12 h 時達到最高值，且在表達初期其變化量都不大。

在低溫脅迫下， 除ChDof06、ChDof07、ChDof08、ChDof09 外的ChDof 基因都能作出響應（圖5D）?；駽hDof01 的表達量呈現先降后升的變化趨勢，低溫脅迫24 h 其表達量最高，是對照的3.9 倍；基因ChDof11 的表達量呈現出升—降—升的變化趨勢，低溫脅迫6 h 其表達量最高，是對照的46.6 倍；基因ChDof20 的表達量呈現出先升后降的變化趨勢，低溫脅迫12 h 其表達量達到峰值，為對照的4.24 倍。

3 討 論

Dof（DNA binding with one finger）家族是一種植物特異性轉錄因子，屬于鋅指蛋白超家族的一個亞家族[21]，主要在植物的生長發(fā)育調控和逆境反應中起作用[22-23]。目前，擬南芥[9]、水稻[9]、玉米[12] 等模式植物和1 年生植物中Dof 基因家族的全基因組均已被鑒定，而多年生植物歐李Dof基因家族的全基因組還未被鑒定，為此，本研究歐李Dof 基因家族成員中共鑒定出了23 個Dof 基因，并將此23 個Dof 基因與擬南芥的36 個Dof基因共同構建了系統(tǒng)進化樹，就AtDof 基因而言，ChDof 基因在植物的進化過程中出現了明顯的縮減現象，且C3 亞組中僅存在AtDof 基因，據此推測，Dof 基因在不同的生物物種中可能存在著進化上的差異。從圖1 中可以看出，ChDof20 和At4G24060.1、ChDof23 和At5G62940.1 的同源性均較高，表明這些基因的親緣關系相對緊密，進一步說明在植物的進化過程中，即使是在不同的物種間，Dof 基因仍然具有一定的保守性。

根據圖2 中歐李Dof 基因的內含子分布情況，可將其內含子分為兩類：一類包含1 個內含子；另一類包含2 個及2 個以上的內含子。亞組A、C2.2、D2 均含有1 個內含子，而亞組B1、C1、D1 均含有2 個內含子，ChDof20 的內含子數量（4 個）最多，這表明親緣關系相近的Dof 基因無論是基因結構還是內含子數量方面均具有較高的相似性。保守基序分布情況顯示，除了D1 亞組外，23 個ChDof 基因均含有保守基序1，這一結果與有關擬南芥[9] 和番茄[10] 的研究結果均相吻合。此外，D1 亞組有2、4、9 這3 個特異保守區(qū)域，這代表歐李絕大多數Dof 基因在其進化過程中都出現了其保守基序丟失的現象，但其仍均存在相同的保守基序1，表明這些Dof 基因在功能上仍然存在一定的相似性。

在對歐李Dof 基因理化性質的分析中發(fā)現，不同的ChDof 蛋白其理化性質存在一定的差異。

但是，亞細胞定位結果顯示，其亞細胞全部位于細胞核中，這與其作為轉錄因子調節(jié)下游基因表達的特點[24] 是一致的。植物在進化過程中會發(fā)生基因復制事件，這是植物體內形成結構相似、功能相仿基因的基礎[25-26]。圖3 顯示，歐李23 個Dof 基因不均勻地分布在8 條染色體上，這一現象與菠菜[27]、毛竹[12]、大白菜[28] 的研究結果均相似。共線性分析結果表明，桃的Dof 基因[29]（Prupe.2G314800.v2.1 即ChDof15）與歐李的2 個Dof 基因為同源基因，即ChDof15 與ChDof12、ChDof15 與ChDof20 這2 對基因為同源基因，表明歐李與桃有著共同的起源，且其親緣關系較近。

23 個ChDof 基因中，共有7 對基因可能是由染色體的大片段復制而形成的，這表明在歐李Dof 家族的擴增和進化中染色體片段重復具有極其重要的作用。

由RNA 聚合酶識別、結合和轉錄的DNA 序列被稱為啟動子，其分布位置是轉錄起始位點上游的幾百至幾千bp 不等，主要作用于基因轉錄的起始過程。由于啟動子序列中存在一系列基本的作用元件，故其能反映基因的潛在功能，從而可以推斷基因的作用[30]。因此，分析啟動子順勢調控元件可以推測基因的作用，從而可為下一步基因功能驗證中基因的篩選奠定基礎。啟動子順式調控元件的分析結果顯示，歐李Dof 基因中與光響應有關的元件含量最為豐富，這與Shaw 等[31]的研究結果相符。其次，含量豐富的就是植物激素反應類元件尤其是其中的ABA 和MeJA 響應元件，已知ABA[20] 和MeJA[32] 調控植物的非生物脅迫，證明了歐李Dof 基因與脅迫響應密切相關。

此外，大多數Dof 基因存在至少1 個ARE 或GCmotif，這代表著大部分歐李Dof 基因家庭成員對無氧環(huán)境都有響應。

以前的研究結果表明，Dof 基因家族成員對各種非生物脅迫均可作出反應。在擬南芥中，AtDof1.1 基因在MeJA 誘導后的表達量上調2 ～3 倍[33]，ATDOF5.8 響應鹽脅迫[34]，高鹽、干旱、高溫和ABA 可誘導CDF3 基因的表達[35]；馬凱恒等[15] 將番茄的SICDF1 和SICDF3 基因轉入擬南芥中，并對轉基因植株進行抗旱處理，結果發(fā)現，其抗旱能力有了明顯的提升。此外，Ma 等[29] 對大白菜Dof 基因的研究結果表明，基因BraDof023、BraDof045 和BraDof074 在干旱和鹽脅迫下的表達量均上調， 低溫則能誘導基因BraDof003、BraDof023、BraDof045 和BraDof053 的表達，且能抑制基因BraDof072 的表達。對ChDof 家族基因在高鹽、滲透、高溫和低溫4 種脅迫下表達情況的研究結果表明，歐李大部分Dof 家族基因在4 種脅迫響應中均起著重要的調節(jié)作用，基因ChDof11、ChDof12、ChDof17 在4 種脅迫處理下的表達量均上升，尤其是基因Dof11，其在受到4 種脅迫的強烈誘導后尤其在低溫脅迫6 h 時的表達量最高，而基因ChDof07 和ChDof08 在4 種脅迫下的表達量均有不同程度的下調；基因ChDof03對高鹽脅迫的反應最為敏感；基因ChDof11 在滲透、高溫和低溫脅迫下的表達量均有極顯著的提高；基因ChDof01 對低溫的響應最為敏感。綜上所述，基因ChDof11、ChDof12、ChDof17 在應激反應中很可能存在許多潛在的功能，尤其是基因ChDof11，其對多種非生物脅迫均能響應，這些基因是值得今后深入研究的候選基因，對這些基因的研究可為后續(xù)歐李抗逆基因的深入研究奠定基礎。但是，若想通過基因手段改良歐李的抗逆性，則需通過遺傳轉化實驗來實現。

4 結 論

本研究共鑒定得到了23 個歐李Dof 基因，并參考擬南芥Dof 基因的命名方法將其劃分為4 個群、9 個亞組，分析中發(fā)現，每個亞組中無論是保守基序還是基因結構都較為相似。23 個ChDof基因中共發(fā)現7 對基因復制事件，表明染色體片段重復可能是歐李Dof 基因家族成員擴增和進化的主要影響因素。歐李Dof 基因啟動子區(qū)域存在多個與激素相關的順式調控元件，據此推測，ChDof 基因可能參與了歐李的逆境脅迫反應。根據非生物脅迫后熒光定量的分析結果，篩選出了ChDof11、ChDof12、ChDof17 這3 個基因， 并推測出這3 個基因在歐李非生物脅迫反應中可能存在許多潛在功能。

參考文獻：

[1] 劉明， 杜俊杰. 歐李種質資源的分布與品種性狀表現[J]. 落葉果樹，2010，42（3）：18-21.LIU M， DU J J. Distribution of germplasm resources andperformance of varieties of Cerasus humilis[J]. Deciduous Fruits，2010，42（3）：18-21.

[2] 汪澤文， 穆霄鵬， 王鵬飛， 等. 歐李ChCBF1 基因的克隆及生物信息學分析[J]. 分子植物育種，2020，18（8）：2490-2496.WANG Z W， MU X P， WANG P F， et al. Cloning andbioinformatics analysis of CBF1 Gene in Cerasus humilis[J].Molecular Plant Breeding，2020，18（8）：2490-2496.

[3] 劉明， 穆曉鵬， 薛曉芳， 等. 歐李生物技術研究進展及其應用展望[J]. 落葉果樹，2010，42（5）：15-17.LIU M， MU X P， XUE X F， et al. Research progress andapplication prospect of biotechnology of Cerasus humilis[J].Deciduous Fruits，2010，42（5）：15-17.

[4] 劉俊， 金鈺， 吳耀松， 等. 植物Dof 基因結構特點及功能研究進展[J]. 生物技術通報，2020，36（10）：180-190.LIU J， JIN Y， WU Y S， et al. Advances on the structuralcharacteristics and function of Dof gene in plant[J]. BiotechnologyBulletin，2020，36（10）：180-190..

[5] 張華珍， 吳昊， 李香花， 等. 一個低氮誘導表達的水稻Dof轉錄因子OsDof-13 的分離和轉化[J]. 分子植物育種，2007，5（4）：455-460.ZHANG H Z， WU H， LI X H， et al. Isolation and transformationof OsDof-13， a member of rice Dof transcription factor family，induced by low nitrogen stress[J]. Molecular Plant Breeding，2007，5（4）：455-460.

[6] WASHIO K. Functional dissections between GAMYB and Doftranscription factors suggest a role for protein-protein associationsin the gibberellin-mediated expression of the RAmy1A gene inthe rice aleurone[J]. Plant Physiology，2003，133（2）：850-863.

[7] YANAGISAWA S， IZUI K. Molecular cloning of two DNAbindingproteins of maize that are structurally different butinteract with the same sequence motif[J]. The Journal ofBiological Chemistry，1993，268（21）：16028-16036.

[8] WANG C M， SONG B B， DAI Y Q， et al. Genome-wideidentification and functional analysis of U-box E3 ubiquitinligases gene family related to drought stress response in Chinesewhite pear （Pyrus bretschneideri）[J]. BMC Plant Biology，2021，21：235.

[9] CORRALES A R， NEBAUER S G， CARRILLO L， et al.Characterization of tomato cycling Dof factors revealsconserved and new functions in the control of flowering timeand abiotic stress responses[J]. Journal of Experimental Botany，2014，65（4）：995-1012.

[10] GUALBERTI G， PAPI M， BELLUCCI L， et al. Mutations in theDof zinc finger genes DAG2 and DAG1 influence with opposite"effects the germination of Arabidopsis seeds[J]. The Plant Cell，2002，14（6）：1253-1263.

[11] CHEN W Q， CHAO G and SINGH K B. The promoter of aH2O2-inducible， Arabidopsis glutathione S-transferase genecontains closely linked-OBF-and OBP1-binding sites[J]. ThePlant Jouranl，1996，10（8）：955-960.

[12] WANG T， YUE J J， WANG X J， et al. Genome-wideidentification and characterization of the Dof gene family inmoso bamboo （Phyllostachys heterocycla var. Pubescens）[J].Genes amp; Genomics，2016，38（8）：733-745.

[13] CAI X F， ZHANG Y Y， ZHANG C J， et al. Genome-wide analysisof plant-specific Dof transcription factor family in tomato[J].Journal of Integrative Plant Biology，2013，55（6）：552-566.

[14] LIJAVETZKY D， CARBONERO P， VICENTE-CARBAJOSA J.Genome-wide comparative phylogenetic analysis of the riceand Arabidopsis Dof gene families[J]. BMC EvolutionaryBiology，2003，3（1）：17.

[15] 馬凱恒， 張彤， 閆鵬宇， 等. 核桃轉錄因子JrDof3 的克隆及滲透脅迫表達分析[J]. 中南林業(yè)科技大學學報，2020，40（10）：35-41.MA K H， ZHANG T， YAN P Y， et al. Cloning and expressionanalysis of walnut transcription factor JrDof3 to osmotic stress[J].Journal of Central South University of Forestry amp; Technology，2020，40（10）：35-41.

[16] 盧夢琪， 周俊琴， 劉懿瑤， 等. 外源鈣離子對NaCl 脅迫下油茶花粉萌發(fā)的影響[J]. 中南林業(yè)科技大學學報，2021，41（6）：91-98.LU M Q， ZHOU J Q， LIU Y Y， et al. Effects of exogenousCa2+ on pollen germination of Camellia oleifera under NaClstress[J]. Journal of Central South University of Forestry amp;Technology，2021，41（6）：91-98.

[17] 王昊， 馬文禮， 靳韋， 等. 歐李全生育期對N、P、K 和水分的吸收規(guī)律[J]. 經濟林研究，2021，39（2）：82-89.WANG H， MA W L， JIN W， et al. Absorption of N， P， K andwater during the whole growth period of Cerasus humilis[J].Non-wood Forest Research，2021，39（2）：82-89.

[18] SCHMITTGEN T D， LIVAK K J. Analyzing real-time PCR databy the comparative C （T） method[J]. Nature Protocols，2008，3（6）：1101-1108.

[19] CAO J， LI X. Identification and phylogenetic analysis of lateembryogenesis abundant proteins family in tomato （Solanumlycopersicum）[J]. Planta，2015，241：757-772.

[20] LI J， CHEN L L， CHANG Y. Cloning of MYB2 Gene fromDryopteris fragrans and its response to ABA and droughtstress[J]. Journal of Northeast Agricultural University （EnglishEdition），2021，28（04）：38-45.

[21] UMEMURA Y， ISHIDUKA T， YAMAMOTO R， et al. TheDof domain， a zinc finger DNA-binding domain conservedonly in higher plants， truly functions as a Cys2/Cys2 Zn fingerdomain[J]. The Plant Journal，2004，37（5）：741-749.

[22] LEE B D， RI K M， YOUNG K M， et al. The F-box protein FKF1inhibits dimerization of COP1 in the control of photoperiodicflowering[J]. Nature Communications，2018，9（1）.

[23] WEN C L， CHENG Q， ZHAO L Q， et al. Identification andcharacterization of Dof transcription factors in the cucumbergenome[J]. Scientific Reports，2016，6：23072.

[24] YANAGISAWA S. Dof domain proteins： plant-specifictranscription factors associated with diverse phenomena uniqueto plants[J]. Plant Cell Physiology，2004，45（4）：386-391.

[25] CANNON S B， MITRA A， BAUMGARTEN A， et al. The rolesof segmental and tandem gene duplication in the evolutionof large gene families in Arabidopsis thaliana[J]. BMC PlantBiology，2004，4（1）：10.

[26] DE G A， LANAVE C， SACCONE C. Genome duplicationand gene-family evolution： the case of three OXPHOS genefamilies[J]. Gene，2008，421（12）：1–6.

[27] YU H Y， MA Y Y， LU Y J， et al. Expression profiling of theDof gene family under abiotic stresses in spinach[J]. ScientificReports，2021，11：14429.

[28] MA J， LI M Y， WANG F T， et al. Genome-wide analysis of Doffamily transcription factors and their responses to abiotic stressesin Chinese cabbage[J]. BMC Genomics，2015，16：33.

[29] ZHANG Z R， YUAN L， LIU X， et al. Evolution analysis of Doftranscription factor family and their expression in response tomultiple abiotic stresses in Malus domestica[J]. Gene，2018，639.

[30] KOLATHUR K K. Role of promoters in regulating alternativesplicing[J]. Gene，2021，782（prepublish）.

[31] SHAW L M， MCINTYRE C L， GRESSHOFF P M， et al.Members of the Dof transcription factor family in Triticumaestivum are associated with light-mediated gene regulation[J].Functional Integrative Genomics，2009，9：485-498.

[32] FENG Y Y， WANG J M， ZHAO Y F， et al. Biosynthesis oforchid-like volatile methyl jasmonate in tea （Camellia sinensis）leaves in response to multiple stresses during the shaking processof oolong tea[J]. LWT，2021，143.

[33] SKIRYCZ A， REICHELT M， BUROW M， et al. DOFtranscription factor AtDof1.1 （OBP2） is part of a regulatorynetwork controlling glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis[J].The Plant Journal，2006，47（1）：10-24.

[34] HE L， SU C， WANG Y， et al. ATDOF5.8 protein is the upstreamregulator of ANAC069 and is responsive to abiotic stress[J].Biochimie，2015，110：17-24.

[35] CORRALES A R， CARRILLO L， LASIERRA P， et al.Multifaceted role of cycling DOF factor 3 （CDF3） in theregulation of flowering time and abiotic stress responses inArabidopsis[J]. Plant， Cell and Environment，2017，40（5）：748-764.

[ 本文編校：伍敏濤]