摘 要:【目的】為澳洲堅果花的功能性食品開發(fā)利用提供參考。【方法】以2 個類群的澳洲堅果品種‘NY2’和‘HAES 695’為試材,對花發(fā)育過程中總酚含量、總黃酮含量、抗氧化活性(清除DPPH 和ABTS 自由基活性、FRAP 值)進行測定分析?!窘Y果】在花的發(fā)育過程中,‘NY2’花的總酚含量、總黃酮含量、抗氧化活性均顯著高于‘HAES695’。其中,‘NY2’花的總酚含量、總黃酮含量、清除DPPH 自由基活性、清除ABTS 自由基活性、FRAP 值均表現為“升—降—升”的變化趨勢,且在花蕾伸長期表現出最高的總酚和總黃酮含量以及抗氧化活性,其次則是花開放盛期;除清除DPPH 自由基活性外,‘HAES695’花的總酚含量、總黃酮含量、清除ABTS 自由基活性、FRAP 值均呈現出“降—升—降”的動態(tài)變化,且在花開放盛期表現出最低的總酚和總黃酮水平以及抗氧化活性,其總酚和總黃酮含量以花蕾初始期與花開放初期較高,抗氧化活性則以花開放初期最高。
相關性分析結果顯示,澳洲堅果花的抗氧化活性與其總酚、總黃酮含量之間均存在極顯著相關性。其中,‘NY2’花的清除DPPH 和ABTS 自由基能力與總酚、總黃酮含量存在極顯著或顯著相關性,而FRAP 值僅與總酚含量極顯著相關;‘HAES695’的FRAP 值和清除ABTS 自由基能力均與總酚、總黃酮含量存在極顯著相關性。
【結論】澳洲堅果花含有豐富的酚類物質和高的抗氧化活性,但在不同類群及其花發(fā)育時期之間差異明顯。
‘NY2’比‘HAES695’具有更高含量的酚類物質和更強的抗氧化能力,二者分別在花蕾伸長期和花開放初期表現出較高的酚類物質水平及抗氧化能力。
關鍵詞:澳洲堅果;花發(fā)育;總酚;總黃酮;抗氧化活性
中圖分類號:S664.9 文獻標志碼:A 文章編號:1003—8981(2023)01—0063—08
澳洲堅果Macadamia 原產于澳大利亞,是南亞熱帶地區(qū)新興的高檔堅果類樹種,其果仁營養(yǎng)豐富、風味獨特,被譽為世界“堅果之王”。中國自20 世紀70 年代末開始引種試種澳洲堅果,截至2016 年底在滇、桂、黔、粵等地區(qū)已種植了20 多萬hm2,成為了世界上澳洲堅果種植規(guī)模最大的國家[1]。在商業(yè)性栽培生產中采用的澳洲堅果品種為源自澳洲堅果屬的光殼種M. integrifolia、粗殼種M. tetraphylla 以及二者的雜交種[2]。其中,光殼種的花為乳白色,粗殼種與雜交種的花均為粉紅色。澳洲堅果花量巨大,1 株成年樹每年可產生25 萬朵以上的花,但僅有低于2% 的花成功發(fā)育為成熟果實[3]。一些果園為了獲得高產,通常對澳洲堅果進行疏花處理,那些被疏除的花常被視為廢棄物而未加以利用。對澳洲堅果花進行有效開發(fā)利用能夠提升澳洲堅果的種植效益,促進其產業(yè)發(fā)展。
近年來,隨著人們生活水平的提高,以可食用鮮花為主要原料加工而成的各種食品悄然流行起來,且已成為一種新興的特色產業(yè)。鮮花中不僅含有豐富的蛋白質、氨基酸、脂類、糖類、維生素及礦物質等營養(yǎng)成分,還含有多酚、類黃酮等抗氧化活性物質,具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能[4]。天然食源性的多酚、類黃酮等活性成分具有抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血脂等功效[5-6]。
Pires 等[7] 認為酚類化合物的抗氧化活性遠高于營養(yǎng)物質,使得可食用鮮花被認為是人類飲食中抗氧化物質的重要來源?;ㄖ蟹宇愇镔|的種類和含量因植物基因型[8-9]、花瓣顏色[9-10]、花發(fā)育時期[11-12] 而異。因此,從食物源中尋找活性物質含量高、抗氧化功能強的可食用花已成為天然藥食兩用保健食品開發(fā)利用研究的重要方向之一。
目前,有關澳洲堅果花的研究僅限于芳香性組分的提取與鑒定[13-14] 等方面,而對其酚類物質和抗氧化特性的研究鮮見報道。本研究中以2 個類群的澳洲堅果代表性品種‘NY2’M. integrifolia和‘HAES695’M. integrifolia×tetraphylla 為試材,比較在花發(fā)育過程中這2 個類群花的總酚、總黃酮含量及其抗氧化活性的變化和差異,探討獲得澳洲堅果花中天然抗氧化物質的適宜樹種和最佳采摘時期,旨在為開發(fā)和利用澳洲堅果花資源提供參考。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
以澳洲堅果光殼種類群的代表性品種‘南亞2 號’(‘NY2’)和雜交種類群的代表性品種‘HAES695’的花為研究對象。所有試材種植于貴州省興義市澳洲堅果示范基地(104°59?E,24°52?N),該基地海拔780 m,立地條件和水肥管理水平基本一致。采樣樹為嫁接繁殖(砧木為‘Hinde’)的9 年生結果樹,株高2.5 ~ 3.0 m,胸徑15 ~ 18 cm,樹勢中庸,樹體生長良好,正常開花。2019 年3 月,在晴天的09:00—10:00,選擇生長發(fā)育狀況較一致的花序,采集花蕾初始期(S1)、花蕾伸長期(S2)、花開放初期(S3)和花開放盛期(S4)的澳洲堅果花,置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2 儀器與試劑
主要儀器包括紫外可見分光光度計(UV-1200,上海美譜達儀器有限公司)、電子分析天平(ML204,瑞士梅特勒- 托利多儀器中國有限公司)、高速冷凍離心機(Heraeus Multifuge X1R,德國莫賽飛世爾科技有限公司)。
主要試劑包括福林酚(Folin-Cioealteu)試劑、沒食子酸、蘆丁、6- 羥基-2,5,7,8- 四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、1,1- 二苯基-2- 苦肼基(DPPH)、2,2′- 聯氨- 雙-(3- 乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸) 二胺鹽(ABTS)、2,4,6- 三吡啶三吖嗪(TPTZ),均購自美國Sigma-Aldrich 公司。
1.3 試驗方法
1.3.1 提取物制備
將待測澳洲堅果鮮花樣品置于研缽中,加液氮研磨成粉狀后,準確稱量1.0 g 至離心管中,分別加入70% 的丙酮溶液10 mL,混勻后于37 ℃水浴中浸提1 h,再經4 ℃下離心(2 200×g)20 min,將上清液過濾后即得提取液。
1.3.2 總酚含量測定
總酚含量的測定參照熊穎等[5] 和Garzón 等[15]的方法,并進行適當修改。將0.5 mL 提取液與2.5 mL 10% 的Folin-Cioealteu 試劑混勻,黑暗中孵育5 min 后,再加入2.0 mL 20% 的Na2CO3 溶液,在30 ℃水浴中避光反應1 h 后,于765 nm 波長下進行比色。以70% 的丙酮溶液代替樣品作為空白,以沒食子酸標準品制作標準曲線,計算總酚的含量(mg/g)。
1.3.3 總黃酮含量測定
總黃酮含量的測定參照熊穎等[5] 和Benamar等[16] 的方法,并略作修改。將0.5 mL 提取液與0.5 mL 5% 的NaNO2 溶液混勻,反應5 min 后加入0.5 mL 10% 的AlCl3 溶液,靜置6 min 后再加入1.5 mL 1.0 mol/L 的NaOH 溶液,在40 ℃水浴中避光孵育15 min,于510 nm 波長下進行比色。以70% 的丙酮溶液代替樣品作為空白,以蘆丁標準品制作標準曲線,計算總黃酮的含量(mg/g)。
1.3.4 抗氧化活性測定
DPPH 自由基清除能力的測定參照Vieira 等[17]的方法,稍加改動。取2.9 mL 現配的DPPH 溶液(50 μmol/L),于517 nm 波長下測定其初始吸光值(A0);再加入0.1 mL 提取液,于30 ℃水浴中避光反應15 min 后,立即測定其吸光值(A1)。
以等量的70%丙酮溶液替代樣品提取液作為空白,用Trolox 為標準物制作標準曲線,計算其抗氧化活性(μmol/g)。計算DPPH 自由基清除率(R1)。
R1=[1-(A1/A0)]×100%。
ABTS 自由基清除能力的測定參照符群等[6] 和Re 等[18] 的方法。將現配的ABTS 反應液(7 mmol/L)用80% 乙醇稀釋至734 nm 處的吸光值為0.70±0.02,作為初始吸光值(A′0)。取0.1 mL 提取液,與2.9 mL 的ABTS 稀釋反應液混勻,于30 ℃水浴中避光反應7 min 后,立即測定其吸光值(A2)。以等量的70% 丙酮溶液替代樣品提取液作為空白,用Trolox 為標準物制作標準曲線,計算其抗氧化活性(μmol/g)。計算ABTS自由基清除率(R2)。
R2=[1-(A2/A′0)]×100%。
總抗氧化能力的測定參照Benzie 等[19] 的方法,略加改動。將乙酸鈉緩沖液(0.3 mol/L,pH 3.6)、TPTZ(10 mmol/L)與FeCl3·6H2O(20 mmol/L)按體積比10∶1∶1 現配FRAP 試劑。取0.15 mL提取液,與2.85 mL FRAP 試劑混勻,在37 ℃水浴中避光反應20 min 后,于593 nm 波長下測定其吸光值。以等量的70% 丙酮溶液替代樣品提取液作為空白,以FeSO4 為標準物制作標準曲線,計算FRAP 值(μmol/g),代表其總抗氧化能力。
1.4 統(tǒng)計分析
試驗數據為3 個重復的平均值,使用SPSS10.0 統(tǒng)計分析軟件對數據進行方差分析和相關性檢驗,采用LSD 法檢驗數據的差異顯著性(P< 0.05)。
2 結果與分析
2.1 澳洲堅果花發(fā)育過程中抗氧化物質含量的變化
對4 個發(fā)育時期的2 個品種澳洲堅果花進行浸提,測得其總酚(沒食子酸等效物)和總黃酮(蘆丁等效物)含量,如圖1 所示。由圖1 可知,在澳洲堅果花的生長發(fā)育過程中,‘NY2’花的總酚和總黃酮含量均表現為“升—降—升”的變化趨勢,其總酚和總黃酮含量分別為25.0 ~ 30.3、20.2 ~ 27.8 mg/g,品種‘HAES695’則均呈現出“降—升—降”的動態(tài)變化,其總酚和總黃酮含量分別為10.9 ~ 21.4、9.4 ~ 15.5 mg/g?!甆Y2’花的總酚和總黃酮含量均由花蕾初始期(S1)的初始值快速上升至花蕾伸長期(S2)的最高值,之后于花開放初期(S3)顯著下降,在花開放盛期(S4)迅速回升,至S4 時,總酚含量仍顯著低于S2,但明顯高于S1,而總黃酮含量與S2 時基本相當,但仍顯著高于S1。與‘NY2’相反,‘HAES695’花的總酚及總黃酮含量均在S1 至S2 時顯著下降,于S3 回升后又顯著下降至S4 的最低值,在S2 至S3 的上升階段,其總酚含量顯著增加至S1 水平,但總黃酮含量增加不明顯。在花的整個發(fā)育期間,‘NY2’花的總酚和總黃酮含量均顯著高于‘HAES695’,且以S2 和S4 尤為明顯,分別是‘HAES695’花總酚含量的1.7、2.5倍,是其總黃酮含量的2.1、2.9 倍。另外,2 個澳洲堅果品種花的總黃酮含量與總酚含量的比值均超過0.7。
2.2 澳洲堅果花發(fā)育過程中抗氧化活性的變化
2.2.1 DPPH 自由基(DPPH·)清除能力的變化
DPPH 法是檢測自由基清除能力的常用方法之一,已被廣泛應用于各種天然提取物抗氧化活性的評價[11-12]。澳洲堅果花在不同發(fā)育時期的DPPH自由基清除活性如圖2 所示。從圖2 可以看出,2 個澳洲堅果品種花均具有較高的DPPH 自由基清除能力,且‘NY2’花清除DPPH 自由基的能力顯著強于‘HAES695’,二者的差異以S1 時尤為明顯,高出了3 倍。在花發(fā)育過程中,‘NY2’花清除DPPH 自由基的能力表現為“升—降—升”
的變化趨勢,以S2 的清除活性最高,其次是S4;‘HAES695’花清除DPPH 自由基的能力則呈現出先升、后降的變化趨勢,以S3 的清除能力最強。
2 個品種花的DPPH 自由基清除能力在不同時期的差異均達到顯著水平。
2.2.2 ABTS 自由基(ABTS+·)清除能力的變化
與DPPH 自由基類似,ABTS 自由基也是穩(wěn)定的水溶性有機自由基,可與具有供氫能力的抗氧化物質反應,生成無色的ABTS,其特征吸光值隨之降低[9,13]。溶液褪色越明顯,則表明所檢測物質的抗氧化活性越強。澳洲堅果花在不同發(fā)育時期的ABTS 自由基清除活性如圖3 所示。由圖3 可知,2 個澳洲堅果品種花的ABTS 自由基清除能力在其不同發(fā)育時期均存在明顯差異。其中,‘NY2’花的ABTS 自由基清除能力在生長發(fā)育過程中表現為“升—降—升”的變化趨勢,以S2 的清除活性最高,其次是S4;‘HAES695’花清除ABTS自由基的活性則呈現出“降—升—降”的動態(tài)變化,以S3 的清除活性最高,S4 的最低?!甆Y2’花的ABTS 自由基清除能力在S2 和S4 時顯著高于‘HAES695’,分別高出70.4% 和114.5%。
2.2.3 總抗氧化能力的變化
FRAP 法是以樣品中的抗氧化物質為還原劑,在一定條件下將Fe3+ 還原為Fe2+ 的能力越大,FRAP 值就越高,其抗氧化活性則越強[10,13]。澳洲堅果花在不同發(fā)育時期的總抗氧化能力如圖4所示。由圖4 可知:在花發(fā)育過程中‘NY2’花的總抗氧化能力變化呈現出先升、后降的趨勢,以S2 的抗氧化活性最高,其余3 個時期則差異不明顯;‘HAES695’花的總抗氧化能力則表現出“降—升—降”的動態(tài)變化,以S4 的抗氧化能力最低,其次是S2,且顯著低于S1 和S3。除S3 外,‘NY2’花的總抗氧化能力在其他3 個時期均顯著高于‘HAES695’,且以S4 時的差異尤為顯著,較‘HAES695’高出了1.1 倍。
2.3 澳洲堅果花發(fā)育過程中抗氧化活性與抗氧化物質含量的相關性
2 個澳洲堅果品種花的抗氧化物質含量與抗氧化活性的相關系數見表1。由表1 可以看出,2 個澳洲堅果品種花的總酚含量均與FRAP 值、清除ABTS 自由基活性之間存在極顯著相關性,‘NY2’
花的總酚含量與清除DPPH 自由基活性之間也存在極顯著相關性。此外,‘NY2’花的總黃酮含量與清除DPPH 自由基活性、清除ABTS 自由基活性之間的相關性均達到顯著水平,‘HAES695’花的總黃酮含量與FRAP 值、清除ABTS 自由基活性之間的相關性均達到極顯著水平。
總體而言,澳洲堅果花的總酚和總黃酮含量均與清除DPPH 自由基活性、清除ABTS 自由基活性、FRAP 值之間存在極顯著相關性,這3 個抗氧化活性指標之間的相關性亦達到極顯著水平(表2)。
3 結論與討論
本研究中對來自2 個類群的澳洲堅果代表性品種花的總酚和總黃酮含量以及抗氧化特性進行了比較分析,初步了解了不同類群澳洲堅果花中酚類物質水平及抗氧化活性的差異,并發(fā)現以‘NY2’為典型代表的澳洲堅果光殼種類群的花具有較豐富的多酚及類黃酮,并在花蕾伸長期表現出最高的酚類物質水平和抗氧化活性,可優(yōu)先作為天然抗氧化物質開發(fā)利用的原料。
植物中的酚類物質是天然的抗氧化劑,攝取后能有效地減少人體氧化損傷,降低相關疾病的發(fā)生率[20]。許多研究報道已證實,諸如石榴[21]、枇杷[22] 與荔枝[23] 等木本果樹的花富含大量的酚類和類黃酮物質,具有較強的抗氧化活性。使用丙酮溶液萃取植物酚類物質的效果要優(yōu)于同等濃度的其他溶液[24]。本研究中使用70% 的丙酮溶液提取不同發(fā)育時期澳洲堅果花的總酚,結果表明‘NY2’ 花的總酚含量為25.0 ~ 30.3 mg/g,‘HAES695’花的總酚含量為10.9 ~ 21.4 mg/g,二者明顯高于Garzón 等[15] 使用相同提取溶劑所獲得的旱金蓮花總酚的含量(5.1 ~ 9.1 mg/g),達到了Zheng 等[25] 報道的65 種可食用花的總酚水平。
另外,在不同發(fā)育時期,‘NY2’花的總黃酮含量為20.2 ~ 27.8 mg/g,而‘HAES695’花的總黃酮含量為9.4 ~ 15.5 mg/g,二者均達到了Xiong 等[24]報道的10 種可食用花的總黃酮水平。這些結果表明,澳洲堅果花含有較豐富的酚類和類黃酮物質,具有開發(fā)成可食用花加工產品的潛能。
酚類物質是植物在正常生長期間與受生物及非生物脅迫應激時所產生的次級代謝產物,其含量通常因植物種類而異,且在植物不同生長發(fā)育期表現出較大差異[22]。史國安等[11] 發(fā)現牡丹花發(fā)育過程中花瓣的總酚含量呈下降趨勢,而類黃酮含量變化因品種而異。白菜花和綠菜花的總酚及類黃酮含量在其整個生長過程中明顯增加,但二者差異較大[10]。本研究中,澳洲堅果品種‘NY2’花中總酚及總黃酮在開花前快速積累,花初始開放時迅速減少但至盛開時又明顯回升,‘HAES695’則表現出與‘NY2’完全相反的動態(tài)變化,二者的總黃酮含量變化特點與史國安等[11] 關于2 個不同顏色牡丹花品種的研究結果類似。另外,‘NY2’澳洲堅果花的總酚和總黃酮含量在整個發(fā)育過程中均顯著高于‘HAES695’,這表明花的酚類物質積累與澳洲堅果種類密切相關,也印證了前人報道的關于菜花[10] 和旱金蓮花[15] 的研究結果,即白色花比彩色花含有更多的酚類物質。對在不同發(fā)育時期2 個澳洲堅果品種花的總黃酮含量與總酚含量的比值進行比較,結果表明其總黃酮含量與總酚含量的比值均達到0.7 以上,且總黃酮含量與總酚含量之間呈極顯著正相關,因此類黃酮是澳洲堅果花中的主要酚類物質,這與Pires 等[7]和Chen 等[26] 關于一些可食用花的研究報道一致。
花的發(fā)育時期對其酚類物質含量和抗氧化能力有較大的影響[11,22]。史國安等[11] 認為牡丹花瓣在露色期的總酚含量最高,但宜在抗氧化活性較高的初開期至盛開期采收。李鳳英等[27] 發(fā)現,玫瑰花在花蕾期含有最高水平的多酚及黃酮,而抗氧化能力以盛開期的花最強,并提出玫瑰花適宜采摘時期為初開期。本研究結果表明,‘NY2’澳洲堅果花在其花蕾伸長期的總酚和總黃酮含量最高,并展示出最大的清除DPPH 自由基活性、清除ABTS 自由基活性及FRAP 值,‘HAES695’則在花開放初期表現出較高的總酚和總黃酮含量以及較強的抗氧化活性,這表明澳洲堅果花在不同花期之間酚類物質含量及抗氧化能力的差異較明顯,且因品種而異。因此,以澳洲堅果花作為天然抗氧化劑的原料時,花蕾伸長期和花開放初期分別是收獲以‘NY2’和‘HAES695’為代表的不同澳洲堅果類群花的適宜時期,該時期的花具有較高的酚類物質和抗氧化活性水平,但應進一步明確其營養(yǎng)價值。
目前,國內外較普遍應用清除DPPH 自由基活性、清除ABTS 自由基活性及FRAP 值等指標對果蔬類產品的抗氧化能力進行體外評價[28-29]。
本研究中,澳洲堅果花的總酚、總黃酮含量以及清除DPPH 自由基活性、清除ABTS 自由基活性及FRAP 值之間均存在極顯著相關性,說明使用這3 個指標可以較好地評價澳洲堅果花的抗氧化能力,與有關番石榴[28]、杧果[29] 和枇杷[22] 的研究結果類似。本研究中還發(fā)現,2 個澳洲堅果品種花的清除DPPH 自由基活性、清除ABTS 自由基活性及FRAP 值均達到了Zheng 等[25] 報道的65 種可食用花的抗氧化能力水平。植物提取物中具有較強抗氧化能力的酚類物質含量越高,通常其抗氧化活性越強。在澳洲堅果花的整個發(fā)育過程中,‘NY2’的清除DPPH 自由基活性是‘HAES695’的1.3 ~ 4.0 倍, 清除ABTS 自由基活性是‘HAES695’的1.3 ~ 1.7 倍,FRAP值是‘HAES695’的1.3 ~ 2.1 倍,這表明酚類物質含量高的‘NY2’花的抗氧化能力明顯強于含量低的‘HAES695’。
總酚含量與抗氧化活性呈顯著相關關系[23,28-29]。但Velioglu 等[30] 認為,一些植物產品的高抗氧化活性與酚類含量并不相關,可能是其他因素起主要作用。周麗萍等[31] 認為,類黃酮可能是雞蛋花花瓣的主要抗氧化劑,在花器官的抗氧化中起重要作用。本研究中,‘NY2’花的總酚含量均與清除DPPH 自由基活性、清除ABTS 自由基活性及FRAP 值呈極顯著相關關系,總黃酮含量僅與清除DPPH 自由基活性、清除ABTS 自由基活性呈顯著相關關系,這表明‘NY2’花的高抗氧化活性主要源自其高含量的酚類物質,類黃酮物質可能在‘NY2’花抗氧化活性的發(fā)揮中未起到主要作用,而是與其他生物活性物質一起形成‘NY2’花的高抗氧化能力。另外,‘HAES695’ 花的清除ABTS 自由基活性和FRAP 值與其總酚、總黃酮含量呈極顯著相關,這說明‘HAES695’花中的酚類物質與其還原高價陽離子能力和清除陽離子自由基活性密切相關,也表明清除ABTS 自由基活性和FRAP 值2 個指標可以較好地體現‘HAES695’花的抗氧化能力。
花中多酚類和黃酮類物質的組分較多,生理活性各異,后續(xù)可進一步采用靶向代謝分析技術鑒定出各組分物質的種類及水平,深入研究各組分的主要生理功能,充分挖掘澳洲堅果花的潛在利用價值,從而為我國澳洲堅果花的功能產品開發(fā)利用提供參考。
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[ 本文編校:聞 麗]