錢瑞，羅世菊，李曉捷，賽珊，趙聚萍，王利芹

（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺 264003）

海帶屬（Saccharina）褐藻，具有異型世代交替生活史，包括二倍性孢子體世代和單倍性配子體世代。在自然界中，海帶配子體一般只存活14 d 左右。20 世紀70年代末，方宗熙等[1]發(fā)現(xiàn)，在人工培養(yǎng)條件下, 雌、雄配子體都能形成無性繁殖系（克?。⒛墚a(chǎn)生配子。海帶配子體克隆技術(shù)的建立，對海帶種質(zhì)保存、配子體克隆育苗、育種及遺傳學研究，具有極其重要的意義。

海帶種質(zhì)保存，通常采用低溫弱光液相保存法，以維持配子體的基礎(chǔ)代謝。若溫度、光照、營養(yǎng)鹽等適宜，配子體則很快進入生長狀態(tài)，可滿足育苗、育種及研究需要。但液相保存一般需15 d更新一次培養(yǎng)液，頻繁操作，增加了種質(zhì)污染及混雜的可能[2]，并且隨著海帶保存規(guī)模的擴大，種質(zhì)庫需要更大的空間，人力物力成本隨之增加。海帶配子體-196 ℃液氮冷凍保存技術(shù)及-80 ℃冷凍保存技術(shù)的開發(fā)[3-5]，可有效彌補液相保存技術(shù)的一些缺陷，特別是-80 ℃冷凍保存技術(shù)操作簡單，降低克隆污染可能性的同時，對保種空間需求更小。-80 ℃凍存海帶配子體克隆，所有克隆系均能成功保存，但每個克隆系配子體細胞存活率相對較低?，F(xiàn)開展了不同濃度二甲基亞砜冷凍保護液對海帶配子體克隆低溫保存的試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

10 個品種（系）海帶克隆系（編號為A—J），每個品種（系）雌、雄配子體克隆系各取1 個（雌性編號1、雄性編號2），共20 個克隆系（A1—J1，A2—J2），均來自國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心海藻種質(zhì)庫。培養(yǎng)溫度4～10 ℃，光照強度2～5 μmol/（m2·s）。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 二甲基亞砜（DMSO）

設(shè)置4 個體積分數(shù)組（5%，10%，15%和20%）的冷凍保護液，對海帶配子體于-80 ℃凍存，觀察不同濃度DMSO 對凍存海帶配子體克隆的影響。

1.2.2 復蘇后配子體

復蘇凍存的雌、雄配子體克隆，培養(yǎng)一定量后，按雌、雄質(zhì)量比2∶1[6]進行發(fā)育試驗，驗證凍存配子體的繁育能力。

1.3 試驗方法

1.3.1 克隆細胞段的獲得

取適量配子體克隆，玻片壓磨后，細胞濾液經(jīng)篩絹過濾至事先放置蓋玻片小片（蓋玻片剪切成小片，能放入凍存管）的培養(yǎng)皿中，在4～10 ℃、2～5 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)7 d，使受損細胞得以修復并附著在蓋玻小片上（為便于觀察統(tǒng)計復蘇后配子體細胞存活率，將配子體細胞附著在玻片上）。

1.3.2 克隆簇狀體的預備

從10 個品種（系）中選取色素正常、狀態(tài)良好、無污染的克隆簇狀體做凍存材料，每個克隆系各稱取0.010 g，克隆簇狀體無須打碎，于-80 ℃直接凍存。

1.3.3 冷凍保護液配制

采用煮沸冷卻的海水為基礎(chǔ)液，配制5%，10%，15%和20%體積分數(shù)的二甲基亞砜冷凍保護液，于0～4 ℃冰箱中存放，備用。

1.3.4 凍存方法

凍存管事先分別加入1 mL 4 種不同體積分數(shù)的DMSO 冷凍保護液，做好標記，放入-20 ℃冰柜預凍24 h 后，取出再分別加入存放于0～4 ℃冰箱相同體積分數(shù)保護液各0.8 mL，凍存管中DMSO處于冰水混合狀態(tài)，保持0 ℃，用鑷子夾取附著克隆細胞段的蓋玻片小片或無水克隆簇狀體，分別置入不同的凍存管中，擰緊蓋子，放入0～4 ℃冷藏箱平衡30 min。平衡結(jié)束，將凍存管于-80 ℃凍存。

1.3.5 復蘇方法

將凍存10 d 的凍存管，從-80 ℃低溫冰箱快速取出，于38～39 ℃的水浴鍋解凍。用鑷子將解凍后附有克隆細胞段的蓋玻片小片及克隆簇狀體取出，分別放入培養(yǎng)皿及錐形瓶中，加低溫培養(yǎng)液，經(jīng)過幾次沖洗，去除冷凍保護劑。于4～10 ℃、2～5 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)；7 d 后置于4～10 ℃、8～10 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)。

1.3.6 凍存的海帶配子體繁育能力

將凍存復蘇后培養(yǎng)的同品種（系）雌、雄克隆系，按雌、雄質(zhì)量比2∶1 的比例，分別取適量克隆系，磨碎后，于細胞濾液過濾至培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿放置在光照強度22～25 μmol/（m2·s）、光周期L∶D=10∶14、溫度10～12 ℃條件下培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍存克隆細胞段存活及生長情況

觀察克隆細胞復蘇后與冷凍前無變化。復蘇后培養(yǎng)3 h，克隆細胞逐漸發(fā)生質(zhì)壁分離。復蘇后培養(yǎng)第7 天，基本可確定克隆細胞是否存活。相同克隆系10%和15% DMSO 體積分數(shù)組的存活率較5%和20%體積分數(shù)組高，見圖1（a）（b）（c）（d）和圖2（a）（b）（c）（d）。觀察10%DMSO 對克隆系A(chǔ)2 的影響，培養(yǎng)第17 天，可見細胞新生枝丫，培養(yǎng)第30 天，細胞生長繁茂，見圖3（a）（b）（c）（d）。復蘇后培養(yǎng)第62 天，存活的細胞長成簇狀體，10%和15%體積分數(shù)組的克隆簇狀體數(shù)量明顯多于5%和20%體積分數(shù)組，見圖4（a）（b）（c）（d）。

圖1 復蘇后培養(yǎng)第7 天，克隆系A(chǔ)2 細胞狀態(tài)（100 倍鏡）

2.2 凍存細胞段存活細胞統(tǒng)計

10%和15% DMSO 2 個體積分數(shù)組的20 個克隆系全部有存活細胞，10%體積分數(shù)組不同克隆系細胞存活率為0.4%～43.2%；15%體積分數(shù)組不同克隆系細胞存活率為0.3%～32.9%；5%體積分數(shù)組14 個克隆系有存活細胞，不同克隆系細胞存活率為0～9.2%；20%體積分數(shù)組只有5 個克隆系有存活細胞，不同克隆系細胞成活率為0～0.9%，見表1。

表1 克隆段復蘇后培養(yǎng)7 d 細胞存活率 %

采用同一體積分數(shù)DMSO 低溫保存海帶配子體克隆，10 個品種（系）海帶雌配子體存活率均不高于同株雄配子體的存活率（表2），可見海帶雄性配子體較雌性配子體有較高的耐受力。

表2 克隆系存活數(shù)量占比 %

2.3 凍存的克隆簇狀體

2.3.1 10%DMSO 對克隆系B1 的影響

復蘇后培養(yǎng)第3 天，在顯微鏡下觀察，海帶配子體克隆色素正常，部分細胞色素聚縮；培養(yǎng)第14天，克隆色素變綠，大部分死亡，有少量色素正常的細胞；培養(yǎng)第49 天，存活細胞無性繁殖形成絲狀體。培養(yǎng)第84 天，形成簇狀體，見圖5（a）（b）（c）（d）。

圖5 10%DMSO 對克隆系B1 的影響（100 倍鏡）

2.3.2 DMSO 4 種體積分數(shù)對克隆系D2 的影響

復蘇后培養(yǎng)3 天，在顯微鏡下觀察，各體積分數(shù)組海帶配子體克隆色素正常，部分細胞色素聚縮。5%體積分數(shù)組在培養(yǎng)第35 天，發(fā)現(xiàn)存活細胞，第50 天，細胞已分裂生長，培養(yǎng)第90 天長，成簇狀團，見圖6（a）（b）（c）（d）。10%體積分數(shù)組，在復蘇培養(yǎng)第7 天，發(fā)現(xiàn)有存活細胞，培養(yǎng)第15 天，細胞已分裂生長，培養(yǎng)第45 天，大量簇狀團出現(xiàn)，見圖7（a）（b）（c）（d）。15%體積分數(shù)組在復蘇后培養(yǎng)第5 天，發(fā)現(xiàn)存活細胞，第25 天，細胞分裂生長，培養(yǎng)第50 天，大量簇狀團出現(xiàn)，見圖8（a）（b）（c）（d）。20%體積分數(shù)組復蘇后培養(yǎng)第50 天，發(fā)現(xiàn)龐大異常的活細胞，培養(yǎng)第80 天，細胞分裂生長，培養(yǎng)第130 天，生長成簇狀團，見圖9（a）（b）（c）（d）。

圖6 5%DMSO 對克隆系D2 的影響（100 倍鏡）

圖7 10% DMSO 對克隆系D2 的影響（100 倍鏡）

圖8 15% DMSO 對克隆系D2 的影響（100 倍鏡）

圖9 20% DMSO 對克隆系D2 的影響（100 倍鏡）

培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，克隆系D2 復蘇后，10%和15%體積分數(shù)組的配子體細胞，較5%和20%體積分數(shù)組的配子體細胞，恢復生長速度更快。

2.4 統(tǒng)計克隆簇狀體存活細胞系

對10 個海帶品種（系）雌、雄共20 個克隆系進行凍存，復蘇后的克隆系置于溫度、光照相同的條件下培養(yǎng)。跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，5%體積分數(shù)組有1 個雌克隆系未見存活細胞，10%和15%體積分數(shù)組雌、雄所有克隆系均有存活細胞，20%體積分數(shù)組有7個雌克隆系未見存活，克隆系存活數(shù)量占比見表3。

表3 克隆系存活數(shù)量占比 %

2.5 -80 ℃凍存后海帶配子體發(fā)育試驗

對上述10%DMSO 冷凍保護液凍存的同株系雌、雄配子體復蘇后進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定量后，進行發(fā)育試驗。結(jié)果表明，培養(yǎng)第14 天，少量孢子體出現(xiàn)，第21 天，大量孢子體形成，見圖10（a）（b）（c）。

圖10 凍存復蘇后海帶配子體發(fā)育能力驗證（100 倍鏡）

為了統(tǒng)計單克隆系的細胞存活率以及便于肉眼觀察20 個克隆系的存活情況，采用打碎的細胞段及未打碎的克隆簇狀體2 種形式進行試驗。試驗結(jié)果稍有不同，5%和20%DMSO 體積分數(shù)組，細胞段克隆系存活比例低于簇狀體克隆系存活比例。5%和20%DMSO 體積分數(shù)可能不是海帶配子體細胞凍存的最適宜體積分數(shù)，凍存后細胞存活率低。本試驗采用細胞段凍存，為便于計數(shù)，細胞段不能重疊，細胞數(shù)量有限，可能會出現(xiàn)某克隆系所統(tǒng)計細胞全部死亡的結(jié)果；而采用簇狀體直接凍存，簇狀體細胞數(shù)量遠大于細胞段細胞數(shù)量，簇狀體中只要有1 個細胞存活并無性繁殖，該克隆系就會存活，因此，試驗發(fā)現(xiàn)簇狀體克隆系存活比例高于細胞段克隆系存活比例。

3 結(jié)論

采用5%，10%，15%，20% 4 種體積分數(shù)的DMSO 冷凍保護液，進行海帶配子體克隆（細胞段和克隆團），于-80 ℃凍存，經(jīng)復蘇后培養(yǎng)，DMSO各體積分數(shù)組均有海帶配子體細胞存活，10%和15%體積分數(shù)組凍存的所有克隆系均有存活細胞，5%和20%體積分數(shù)組僅部分克隆系有存活細胞。對于相同克隆系，10%和15%體積分數(shù)組配子體存活率高于5%和20%體積分數(shù)組。結(jié)果表明，海帶配子體凍存可用10%和15%DMSO 作為冷凍保護液。為降低成本，優(yōu)選10%DMSO作為冷凍保護液，凍存不影響海帶配子體繁育能力，其在-80℃凍存復蘇后培養(yǎng)，可正常發(fā)育為孢子體。