王 娟，范婷婷，劉豐茂

(中國農(nóng)業(yè)大學理學院，北京 100193)

1 前言

2-(乙酰氧基)苯甲酸(Acetylsalicylic acid，ASA)又稱阿司匹林，乙酰水楊酸，是一種廣泛用于農(nóng)業(yè)中的植物生長調(diào)節(jié)劑[1]。外源施用能夠有效減輕活性氧對植物葉面細胞膜的傷害，使細胞膜結(jié)構的穩(wěn)定性得到保護，有效地調(diào)節(jié)植物葉面毛孔關閉抑制葉片水分蒸騰，延續(xù)作物衰老，具有細胞激活、抗旱、助長、抗病作用[2-5]。目前已經(jīng)建立了2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC-MS[1，6]分析方法，雖然方法靈敏度很高，但不適合用于農(nóng)藥產(chǎn)品的定量分析；此外，還報道了通過分光光度法[7]和化學滴定法[8]快速地測定藥片中2-(乙酰氧基)苯甲酸的含量，但結(jié)果會產(chǎn)生較大誤差。有研究也建立了2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC法，操作簡單、應用范圍廣[9-10]，檢測結(jié)果能達到農(nóng)藥產(chǎn)品定量分析的檢測要求，但在研究中并未對其在分析過程中易分解成水楊酸的問題進行探討并對分析條件進行優(yōu)化。

本文針對已登記的產(chǎn)品，建立了有效成分2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC相分析方法，探討了其在分析過程中易分解成水楊酸的問題，還通過對溶解溶劑、流動相、洗脫方式及特異性參數(shù)進行了方法優(yōu)化，并對99%原藥及30%可溶粉劑進行了分析。最終所建立方法具有快速、穩(wěn)定、分離效果好、應用范圍廣等特點，符合農(nóng)藥產(chǎn)品定量分析的檢測要求，為農(nóng)藥產(chǎn)品標準分析方法的建立提供依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 試劑 甲醇(色譜純)，冰乙酸，氯化鉀(分析純)；水：新蒸二次蒸餾水或超純水；2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥(99%)和標樣(ω≥99.8%)，水楊酸標樣(ω≥99.8%)；2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑(30%)。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent1260，具有可變波長紫外檢測器；Agilent色譜工作站；色譜柱：250 mm×4.6 mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝Innoval C18、5 μm填充物；微量進樣器：50 μL；定量進樣管：5 μL。

2.3 色譜操作條件 流動相：Ψ(甲醇∶0.1%冰乙酸溶液)=45∶55；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：276 nm；進樣體積：5 μL；保留時間：2-(乙酰氧基)苯甲酸約6.6 min。典型的2-(乙酰氧基)苯甲酸標樣和樣品色譜圖(圖1～3)。

圖1 2-(乙酰氧基)苯甲酸標準品HPLC圖

2.4 測定步驟

2.4.1 標樣溶液配制 稱取0.02 g(精確至0.000 01 g)2-(乙酰氧基)苯甲酸標樣于25 mL容量瓶中，加入適量1%冰乙酸甲醇溶液，超聲5 min，冷卻至室溫，用1%冰乙酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻備用。

圖2 99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥的HPLC圖

圖3 30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑的HPLC圖

2.4.2 試樣溶液的配制 稱取0.02 g(精確至0.000 01 g)2-(乙酰氧基)苯甲酸試樣于25 mL容量瓶中，加入適量1%冰乙酸甲醇溶液，超聲5 min，冷卻至室溫，用1%冰乙酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻備用。

2.4.3 測定 在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液，直至相鄰2針2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面積相對變化<1.2%后，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

高溫對體外唾液鏈球菌clpP基因表達的影響 … ……………………………… 朱銘慧，等(12):1396

2.4.4 計算 將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面積分別進行平均。試樣中2-(乙酰氧基)苯甲酸質(zhì)量分數(shù)按以下公式計算：

式中：

ω1—試樣中2-(乙酰氧基)苯甲酸的質(zhì)量分數(shù)，%；

A2—試樣溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面積的平均值；

m1—2-(乙酰氧基)苯甲酸標樣的質(zhì)量，g；

ω—標樣中2-(乙酰氧基)苯甲酸的質(zhì)量分數(shù)，%；

A1—標樣溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面積的平均值；

m2—試樣的質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測波長的選擇 2-(乙酰氧基)苯甲酸的紫外光譜圖(圖4)，從圖中可以看到在190～400 nm范圍內(nèi)，2-(乙酰氧基)苯甲酸在235 nm和276 nm處有紫外特征吸收峰。由于235 nm近紫外末端，干擾較大，為減少干擾，因此本方法將檢測波長確定為276 nm，這也與前期研究報道的檢測波長一致[11]。

圖4 2-(乙酰氧基)苯甲酸的紫外光譜圖

3.2 溶解溶劑的選擇 因2-(乙酰氧基)苯甲酸苯環(huán)上的乙?；菀姿獬伤畻钏岷鸵宜?圖5)，本研究比較了不同溶劑(甲醇和1%冰乙酸甲醇)溶解2-(乙酰氧基)苯甲酸產(chǎn)品時的效果。當使用純甲醇溶解2-(乙酰氧基)苯甲酸產(chǎn)品時，部分2-(乙酰氧基)苯甲酸會發(fā)生分解，產(chǎn)生水楊酸(圖5)，在以往的文獻中也有相似的報道[8]。

圖5 2-(乙酰氧基)苯甲酸水解產(chǎn)生水楊酸和乙酸反應式

當在溶劑中加入適量乙酸，使用1%冰乙酸甲醇溶解時，能有效抑制2-(乙酰氧基)苯甲酸分解成水楊酸，有效成分會更穩(wěn)定(圖6)。因此本方法選擇1%冰乙酸甲醇作為溶解2-(乙酰氧基)苯甲酸農(nóng)藥產(chǎn)品的溶劑。

圖6 甲醇溶解(左)、1%冰乙酸甲醇溶解(右)色譜圖(峰1—2-(乙酰氧基)苯甲酸；峰2—水楊酸)

3.3 流動相、洗脫方式的選擇 為了得到更好的分離效果和峰形，本研究比較了不同流動相及洗脫方式對有效成分色譜峰的影響，流動相采用甲醇/水、甲醇/0.1%冰乙酸水溶液(pH=3.3)。

結(jié)果表明，當流動相中不加入冰乙酸時，會出現(xiàn)明顯的水楊酸峰(圖7A)，說明目標化合物水解嚴重；當在流動相中加了0.1%冰乙酸后，水解受到抑制，穩(wěn)定了2-(乙酰氧基)苯甲酸(圖7B、C)。

在對比等度洗脫和梯度洗脫效果時發(fā)現(xiàn)，當使用梯度洗脫時，洗脫程序(表1)，有效成分的色譜峰峰型更好，峰寬更窄(圖7B)；而使用甲醇：0.1%冰乙酸溶液進行等度洗脫時，有效成分的色譜峰峰型偏寬(圖7C)。從儀器設備角度考慮，梯度洗脫更復雜，對儀器設備要求更高。將流動相按不同比例在色譜柱上進行試驗，隨著甲醇比例減少，雜質(zhì)水楊酸出峰時間越晚，運行時間延長，最終選擇甲醇∶0.1%冰乙酸溶液(V/V，45∶55)作為流動相。該條件下，2-(乙酰氧基)苯甲酸色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離，并且分析時間較短，提高了工作效率。

圖7 不同流動相洗脫色譜圖A：甲醇：水等度洗脫、B：甲醇：0.1%冰乙酸溶液梯度洗脫、C：甲醇：0.1%冰乙酸溶液45∶55等度洗脫

3.4 特異性實驗 本試驗采用HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別2-(乙酰氧基)苯甲酸。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)因有效成分2-(乙酰氧基)苯甲酸在235 nm有吸收，流動相中又含有乙酸，其截止波長為230 nm。因此在采用梯度洗脫時，乙酸含量變化會影響方法特異性，計算特異性的起始波長選取對峰吸收純度干擾很大(表2)，起始波長達到240 nm，特異性才合格。而當選擇等度洗脫時，乙酸含量是恒定的，干擾因素大大降低，計算特異性的起始波長選取對對峰吸收純度影響較小，起始波長在200 nm以上特異性就合格。因此當采用梯度洗脫時，應注意選取高于溶劑截止波長的起始波長進行特異性參數(shù)確認。而采取等度洗脫時未發(fā)現(xiàn)溶劑截止波長對特異性的影響，因此本方法洗脫方式最終選擇等度洗脫。

表2 梯度洗脫時不同起始波長對純度因子的影響

圖8 2-(乙酰氧基)苯甲酸標樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

3.5 分析方法的線性相關性試驗 按標樣溶液制備方法配制(201.6～2016.0 mg/L)5個不同濃度的有效成分線性相關溶液，測定每個溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果，2-(乙酰氧基)苯甲酸質(zhì)量濃度在201.6～2 016.0 mg/L之間與相應的峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關系，線性回歸方程為y=1.756 86x+23.487 31，R=0.999 8，可以滿足定量分析要求。

3.6 分析方法的精密度試驗 按2.5.2試樣溶液的制備方法配制5個99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥的精密度溶液，和5個30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑的精密度溶液，進行測定，測得99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥和30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑標準偏差分別為0.49%和1.42%，變異系數(shù)分別為0.49%和1.42%，結(jié)果表明(表3)該分析方法具有良好的重現(xiàn)性、良好的精密度。

表3 虱螨脲(氯蟲苯甲酰胺)的線性相關性試驗數(shù)據(jù)

表3 2-(乙酰氧基)苯甲酸精密度試驗結(jié)果

3.7 方法準確度實驗 稱取0.01 g(精確至0.000 01 g)2-(乙酰氧基)苯甲酸的30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑于25 mL容量瓶中，再加入2-(乙酰氧基)苯甲酸標樣0.01 g(精確至0.000 01 g)，按2.5.2試樣溶液的制備方法配制5個30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑的準確度溶液進行測定。

實驗結(jié)果可知，按所建立的方法進行HPLC測定，其添加回收率在98.21%～99.33%范圍內(nèi)(表4)，符合農(nóng)藥產(chǎn)品定量分析的檢測要求。

4 結(jié)論

本文建立了2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC分析方法，并對溶劑對樣品的穩(wěn)定性影響，梯度或等度洗脫的差異，以及特異性參數(shù)設置對純度因子的影響進行了研究，得出以下幾條結(jié)論：

(1)2-(乙酰氧基)苯甲酸易分解為水楊酸和乙酸，因此在溶解此類產(chǎn)品時，在溶劑中加入一定量的冰乙酸，同時在流動相中也加入冰乙酸，都能有效抑制其分解，能在產(chǎn)品定量分析時提高準確度。

(2)在對2-(乙酰氧基)苯甲酸進行梯度洗脫時，能產(chǎn)生比等度洗脫峰形更好、峰寬更窄的色譜峰，但梯度洗脫更復雜，對儀器設備要求更高。此外，在進行梯度洗脫時，乙酸含量變化會影響方法特異性，需選取高于溶劑截止波長的起始波長進行特異性參數(shù)確認；因此推薦選用等度洗脫。

(3)方法以甲醇∶0.1%冰乙酸溶液(V/V，45∶55)為流動相，等度洗脫，使用Innoval C18色譜柱和二極管陣列檢測器，在276 nm的檢測波長下，對99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥及30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑進行分析。方法確證結(jié)果表明，該分析方法條件下的2-(乙酰氧基)苯甲酸的線性相關系數(shù)為0.999 8，99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥及30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑變異系數(shù)分別為0.49%和1.42%，30%2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶性粉劑的平均回收率分別為98.58%。此方法快速、靈敏，具有良好的線性關系、準確度和精密度，是2-(乙酰氧基)苯甲酸產(chǎn)品質(zhì)量控制的有效可行的分析方法。