李萍，許紅霞，孟葆林，曹旭東

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌，staphylococcus aureus,SA)是一種廣泛存在于自然界、人體的化膿性病原菌，也是常見的與社區(qū)、醫(yī)院獲得性疾病相關(guān)的病原體。金葡菌侵入機(jī)體后產(chǎn)生多種毒素和毒力因子，逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的防御，引起局部和全身的浸潤性感染[1]。β-內(nèi)酰胺、大環(huán)內(nèi)酯類等藥物是治療金葡菌感染的常用抗生素，金葡菌對(duì)這些抗生素的耐藥性迅速增加，多種耐藥基因在金葡菌分離株中被頻繁報(bào)道，已被WHO確定為全球關(guān)注的重要問題。金葡菌的耐藥性除與相關(guān)的結(jié)合蛋白、基因表達(dá)調(diào)控等有關(guān)外，還與其黏附能力有關(guān)，由金葡菌引起的慢性生物膜相關(guān)感染通常會(huì)導(dǎo)致感染率和病死率顯著增加[2]。金葡菌對(duì)不同種類的抗生素有不同耐藥機(jī)制，使抗感染的治療復(fù)雜化。本文通過探討金葡菌耐藥機(jī)制，以期為金葡菌的致病性研究及治療提供參考。

1 青霉素結(jié)合蛋白(PBP)

1.1 PBP2a 傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素、甲氧西林等在金葡菌感染中廣泛存在耐藥性。β-內(nèi)酰胺類抗生素中含有β-內(nèi)酰胺酶，能使青霉素或結(jié)構(gòu)相似的藥物失活，介導(dǎo)的耐藥性通常是窄譜的，該酶由blaZ基因編碼，blaZ基因維持在質(zhì)粒中[3]。β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌活性還能通過與青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)共價(jià)結(jié)合，抑制PBP介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞壁合成的轉(zhuǎn)肽酶活性。PBPs是β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要靶點(diǎn)，也是細(xì)菌細(xì)胞壁生物合成的重要物質(zhì)，在細(xì)菌的分裂期通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁合成發(fā)揮關(guān)鍵作用，確保細(xì)菌從母代向子代的分離[4]。每個(gè)金葡菌菌株均有4個(gè)核心基因組編碼的PBPs(PBP1～4)，PBP1在金葡菌中主要起轉(zhuǎn)肽酶的作用，PBP3與金葡菌的自溶有關(guān)，PBP4與金葡球菌β-內(nèi)酰胺類耐藥有關(guān)[5]。PBP2a因其對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生高水平和廣譜耐藥性而備受關(guān)注。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥是由PBP2a或PBP2′低親和力介導(dǎo)所致，其允許細(xì)菌在高濃度藥物存在下合成細(xì)胞壁，PBP2a和PBP2′分別由mecA和mecC基因編碼[6]。PBP2a的合成受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MecI和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白MecR1的調(diào)控，MecI和MecR1基因編碼于葡萄球菌染色體盒元件SCCmec/mecA中[7]。MecI和MecR1分別與BlaI和BlaR1具有很高的蛋白序列相似性，可調(diào)節(jié)PBP2a表達(dá)的功能。因此，在MRSA的許多臨床分離株中，攜帶blaI和blaR1基因的質(zhì)?？删幋a調(diào)節(jié)PBP2a表達(dá)的蛋白質(zhì)[8]。不同金葡菌菌株中出現(xiàn)的耐β-內(nèi)酰胺類藥物模式表明，其潛在的耐藥機(jī)制是一種普遍的耐藥機(jī)制[9]。

1.2 PBP4 PBP4是金葡菌中的一種非必需的、低分子量青霉素結(jié)合蛋白，研究表明PBP4可介導(dǎo)金葡菌的高水平和廣譜β-內(nèi)酰胺耐藥，PBP4可在部分交聯(lián)的肽聚糖上進(jìn)行酶活化，以非從頭開始的方式修復(fù)細(xì)菌肽聚糖缺陷，促進(jìn)細(xì)胞壁的穩(wěn)定性[10]。Basuino等[11]研究顯示，在金葡菌菌株中，檢測(cè)到高頻率PBP4啟動(dòng)子突變和圍繞PBP4活性位點(diǎn)的錯(cuò)義突變，PBP4啟動(dòng)子突變導(dǎo)致PBP4產(chǎn)生過量，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞壁的交聯(lián)；PBP4的活性是表現(xiàn)高水平β-內(nèi)酰胺耐藥的關(guān)鍵，而PBP4的錯(cuò)義突變及其啟動(dòng)子突變共同促進(jìn)了β-內(nèi)酰胺的耐藥。Greninger等[12]學(xué)者對(duì)9種金葡菌子代菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，以確定與第五代頭孢菌素類抗生素高度、mecA無關(guān)的耐藥相關(guān)的突變，其中5株來自5個(gè)不同親本菌株的頭孢他林耐藥株均產(chǎn)生了PBP4啟動(dòng)子突變，而其中4個(gè)(80%)與編碼PBP4 Asn138殘基突變的PBP4單核苷酸多態(tài)性相關(guān)，結(jié)果顯示PBP4基因的錯(cuò)義或其啟動(dòng)子的突變與第五代頭孢菌素的耐藥性密切相關(guān)。研究表明，PBP4基因和啟動(dòng)子突變共同對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性產(chǎn)生協(xié)同作用，PBP4與PBP2/2a的相互作用促進(jìn)了對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性[13]。

2 mecA基因

mecA基因與β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性有關(guān)，mecA基因廣泛分布于多種葡萄球菌中，mecA基因表達(dá)受DNA結(jié)合蛋白MecI和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子MecR1調(diào)控，編碼青霉素結(jié)合蛋白PBP2a或PBP2′，對(duì)許多半合成青霉素(包括甲氧西林、萘菲林和苯唑西林)及大多數(shù)頭孢烯類藥物具有低親和力，與青霉素酶介導(dǎo)的耐藥性不同，mecA引起的耐藥性是廣譜的[14]。與天然PBPs相比，mecA基因產(chǎn)物通過降低β-內(nèi)酰胺介導(dǎo)的酶酰化速率和對(duì)β-內(nèi)酰胺的親和力而產(chǎn)生耐藥性。在不同種類的葡萄球菌中已鑒定出mecA1和mecA2兩種mecA基因同源型[15]。mecA攜帶一種可移動(dòng)的遺傳元件SCCmec，SCCmec高度多樣，迄今為止已識(shí)別出11種類型(I至XI)，它們?cè)诖笮?從21 kb到67 kb)上存在差異，其抗藥性因SCCmec類型而異。該元件在葡萄球菌之間轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生廣譜β-內(nèi)酰胺耐藥。目前已知的SCCmec元件攜帶以下常見的基因復(fù)合物：orfX(便于SCCmec整合到金葡菌基因組的attB位點(diǎn)序列中)；5類mec盒基因(包括MecA、MecC、MecB及其位于MecA上游的調(diào)控蛋白MecR和MecI)；側(cè)翼插入序列元件(IS431和IS1272)；重組酶ccrA、ccrB和ccrC 3個(gè)同素型，ccr同素型之間的序列相似性<50%，負(fù)責(zé)SCCmec的切除和整合；SCCmec還可能包含其他基因結(jié)構(gòu)，如pT181和pUB110，這些結(jié)構(gòu)導(dǎo)致對(duì)其他非β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性；其他重金屬和抗生素抗性基因，如ars和blaZ等[16-17]。Greninger等[12]研究表明缺乏mecA基因的金葡菌菌株能發(fā)展成高水平的β-內(nèi)酰胺類抗藥性。

3 erm基因

以紅霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，通過與50S核糖體亞基的肽基轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)合成。金葡菌已對(duì)長期使用紅霉素者產(chǎn)生高度耐藥性。金葡菌對(duì)紅霉素耐藥的機(jī)制有兩點(diǎn)：一是通過erm(紅霉素抗性甲基化酶)基因編碼介導(dǎo)核糖體靶位點(diǎn)的修飾，二是由msrA/B(大環(huán)內(nèi)酯類特異性耐藥基因)和ereA/B(紅霉素酯酶)基因編碼的依賴ATP的外排泵，其中依賴erm基因編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)核糖體靶點(diǎn)的修飾是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要機(jī)制[18]。erm基因編碼的蛋白質(zhì)使23S rRNA結(jié)構(gòu)域肽基轉(zhuǎn)移酶區(qū)的腺嘌呤殘基A2058/2059甲基化，并導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯、林可酰胺和鏈球菌素B(MLSB)等抗生素耐藥性[19]。erm基因介導(dǎo)的耐藥菌株表現(xiàn)出兩種表型：組成型MLSB(cMLSB)和誘導(dǎo)型MLSB(iMLSB)，不同表型與不同的分子調(diào)控機(jī)制有關(guān)。在iMLSB株中erm的翻譯起始受到抑制，其mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)被紅霉素與先導(dǎo)肽結(jié)合后隔離，促使mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)釋放，限制erm的作用。cMLSB菌株允許誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物的獨(dú)立翻譯，因其先導(dǎo)肽基因序列的變異會(huì)消除翻譯[20]。Jarajreh等[21]研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌對(duì)紅霉素、克林霉素的耐藥性主要是由ermA或ermC基因引起的。ermA是MRSA菌株中最常見的基因，位于轉(zhuǎn)座子Tn554上，能插入金葡菌染色體的不同區(qū)域；ermC是導(dǎo)致金葡菌菌株中大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的最常見基因，由質(zhì)粒攜帶。在金葡菌中還發(fā)現(xiàn)了ermB、ermF、ermY和lunA等對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類林可酰胺類和鏈霉素耐藥的基因[22]，表明大環(huán)內(nèi)酯類的一種或幾種新的耐藥機(jī)制可能在金葡菌中廣泛存在。

4 tetM和tetK基因

四環(huán)素類藥物主要通過阻止氨基酰tRNA進(jìn)入核糖體而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。金葡菌對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥機(jī)制主要有兩種：由質(zhì)粒編碼的tetK和tetL基因介導(dǎo)的主動(dòng)外排和由染色體或轉(zhuǎn)座子tetM或tetO基因編碼的核糖體保護(hù)蛋白，保護(hù)核糖體免受藥物作用[23]。大多數(shù)攜帶tetL的菌株也攜帶其他四環(huán)素抗性基因，如tetM和tetK。tetM和tetK的基因通常位于染色體上的DNA，tetM的耐藥性可能與整合和結(jié)合轉(zhuǎn)座子相關(guān)，促進(jìn)基因之間水平轉(zhuǎn)移，該元件也可攜帶編碼氯霉素抗性的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)基因；tetL基因通常是通過質(zhì)粒傳播的，相應(yīng)的質(zhì)粒大小不同，可能攜帶額外的抗性基因；四環(huán)素抗藥性基因tetM和tetK與可移動(dòng)基因元件的結(jié)合可能促進(jìn)抗藥性性狀在MRSA中的傳播[24]。De Vries等[25]研究表明人類來源的金葡菌含有不同的tetM基因，位于Tn916和Tn5801樣的結(jié)合轉(zhuǎn)座子上；不同動(dòng)物來源的金葡菌含有一種特定類型的tetM，位于Tn916類元素上，并首次報(bào)道Tn5801、Tn6014可在金葡菌分離株之間轉(zhuǎn)移。

5 生物膜的形成

細(xì)菌的生物膜基質(zhì)和表型特征賦予宿主免疫反應(yīng)和抗菌藥物作用的抵抗力，并受多方面和重疊的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，不同的金葡菌菌株的生物膜組成不同，出現(xiàn)具有不同生理特性的藥物難治性細(xì)胞亞群，并導(dǎo)致難治性細(xì)菌感染患者的治療失敗[26]。在金葡菌中，生物膜分離受輔助基因調(diào)節(jié)器Agr(accessory gene regulator)，被認(rèn)為是一個(gè)在浮游和生物膜狀態(tài)之間的重要調(diào)節(jié)開關(guān)[27]。其可下調(diào)細(xì)胞表面相關(guān)蛋白的表達(dá)，并上調(diào)胞外毒素(溶血素、腸毒素)胞外蛋白酶等的表達(dá)。Agr介導(dǎo)的生物膜擴(kuò)散與SspA、SspB、Aur和Scp等胞外蛋白酶的分泌相關(guān)[28]。研究發(fā)現(xiàn)Agr功能失調(diào)的菌株比功能正常的菌株更具耐藥性[29]。金葡菌還能以icaADBC編碼的多糖細(xì)胞間黏附作為生物膜形成的機(jī)制，攜帶ica位點(diǎn)是大多數(shù)臨床金葡菌菌株的特征，Agr系統(tǒng)的缺失增強(qiáng)了臨床MRSA菌株的生物膜形成，Agr位點(diǎn)編碼分別由P2和P3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的RNAⅡ和RNAⅢ轉(zhuǎn)錄體。在人類MRSA分離株中，纖維連接蛋白結(jié)合蛋白(FnBPs)被證明是獨(dú)立于ica的生物膜形成因素，F(xiàn)nBP是一種多功能表面蛋白，由參與纖維粘連蛋白結(jié)合的串聯(lián)重復(fù)序列分離。FnBP蛋白FnBPA和FnBPB均參與了醫(yī)院和社區(qū)分離株在靜態(tài)和流動(dòng)條件下MRSA生物膜形成的累積階段[30]。此外，SasG通過SasG蛋白的同質(zhì)均可促進(jìn)細(xì)胞間聚集，SasG蛋白的重復(fù)B結(jié)構(gòu)域促進(jìn)生物膜形成，B結(jié)構(gòu)域通過在細(xì)胞表面形成伸展的纖維，以Zn2+依賴的方式促進(jìn)獨(dú)立于ica的生物膜的形成[31]。

6 小 結(jié)

金葡菌是臨床上常見的病原菌之一，感染后過度、不合理地使用抗生素導(dǎo)致耐藥菌株的增加和治療失敗率的增高，對(duì)不同種類的抗生素有不同耐藥機(jī)制，金葡菌菌株中抗生素耐藥基因的出現(xiàn)和快速傳播給全球公共衛(wèi)生帶來了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。金葡菌的耐藥性與相關(guān)的結(jié)合蛋白、特異性耐藥基因表達(dá)調(diào)控、抗生素結(jié)合位點(diǎn)改變、產(chǎn)生降解或改變抗生素結(jié)構(gòu)的、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因突變、黏附能力等有關(guān)，還可能與出現(xiàn)新抵抗力的菌株流行、菌株基因突變、細(xì)菌免疫逃逸有關(guān)。金葡菌的分子特征因區(qū)域而異，其多樣的耐藥機(jī)制使金葡球耐藥嚴(yán)重，臨床感染治療復(fù)雜化?？咕幬锩舾行院湍退幓蚍植嫉难芯繉?duì)醫(yī)院感染控制具有重要意義。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其耐藥性監(jiān)測(cè)，同時(shí)根據(jù)藥敏結(jié)果合理選用抗菌藥物。此外，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)鑒定金葡菌毒力因子、克隆復(fù)合物和序列類型判斷耐藥，靶向篩選其抗性表型和相關(guān)的抗性基因型可作為評(píng)價(jià)金葡菌抗性的重要參考。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。