胡俊茹,朱喜鋒,李國立1,,趙紅霞,王國霞,黃文慶1,,黃燕華
(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室,廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室,廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室,廣州 510640;2.廣州飛禧特生物科技有限公司,廣州 510640)
高密度集約化養(yǎng)殖易產(chǎn)生水產(chǎn)動物機體免疫功能下降、抗應(yīng)激能力減弱、病害頻發(fā),養(yǎng)殖過程過多依賴藥物,導致水產(chǎn)動物藥殘超標?!敖埂⑾蘅?、無抗”是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的必然要求。β-葡聚糖被視為綠色、安全的免疫增強劑,其促生長、抗氧化、抗菌和抗病毒的作用已在花鱸(Lateolabraxjaponicas)[1]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[2]、奧尼羅非魚(Oreochromisaureus♂×O.niloticus♀)[3-4]、齊口裂腹魚(SchizothoraxprenantiTchang)[5]、亞東鮭幼魚(Salmontrutta)[6]、鯧(TrachinotusovatusLinnaeus)[7]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[8]、鯉(Cyprinuscarpio)[9]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvanname)[10]、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)[11]中被證實。
大口黑鱸(Micropterussalmoides),俗名加州鱸,隸屬鱸形目(Perciformes)太陽魚科(Cehtrachidae)黑鱸屬(Micropterus),為肉食性溫水魚類,是我國主養(yǎng)淡水魚品種之一。近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模及養(yǎng)殖密度的大幅提升,大口黑鱸養(yǎng)殖過程中病害發(fā)生情況日益嚴重,養(yǎng)殖戶蒙受重大的經(jīng)濟損失。增強機體免疫是提高水產(chǎn)動物生長和抗病抗應(yīng)激能力的重要途徑,因此,本實驗在配合飼料中添加一定梯度的β-葡聚糖,研究不同含量的β-葡聚糖對大口黑鱸生長性能、體組成和抗氧化能力的影響,闡明β-葡聚糖對大口黑鱸生長和抗氧化能力的作用效果,提出合理的添加量,以期為養(yǎng)殖中合理使用β-葡聚糖提供理論依據(jù)和支撐。
在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%的β-葡聚糖(β-葡聚糖實際含量52.8%,廣州飛禧特生物科技有限公司)配置5組實驗飼料,分別記為G0、G1、G2、G3、G4。飼料制備之前,魚粉等飼料原料經(jīng)粉碎后過60目篩網(wǎng),然后按照配方表準確稱取混勻后倒入V型攪拌機(廣東新聯(lián)合包裝食品機械有限公司,型號:VH-0.03 m3)充分混合。隨后稱取魚油、豆油、磷脂油,混合后將其倒入已混合均勻的原料內(nèi),再使用混合機(廣州市維拉維機械設(shè)備有限公司,型號:VHJ-50B)連續(xù)攪拌至均勻,最后按照30%左右加入適量的水繼續(xù)攪拌。攪拌均勻后的物料使用T-50雙螺桿擠壓膨化機(羅定市李華強膨化機械經(jīng)營部,型號:T52)進行膨化,切刀轉(zhuǎn)速調(diào)整在20~30轉(zhuǎn)左右,將其制成直徑為3.0 mm的膨化顆粒(出料模1.5 mm),膨化溫度為(115±5) ℃,待膨化好之后采用一臺八角攪拌機進行人工噴油,然后放入54 ℃的烘箱內(nèi)烘干,再在室溫下進行回潮。制好的飼料采用封口袋封裝,于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。
表1 實驗飼料及營養(yǎng)水平(風干物質(zhì))
大口黑鱸幼魚購于佛山市三水白金種苗有限公司,暫養(yǎng)期間,投喂大口黑鱸商品飼料。養(yǎng)殖實驗在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行,挑選平均初始重為9.60 g的幼魚750尾,隨機分到長×寬×深為1.5 m×1.5 m×2.0 m的實驗網(wǎng)箱中,每箱50尾,3個重復為1組,隨機分成5組。于每天上午09:00和下午16:00飽食投喂2次。記錄每天的水溫、pH值、溶氧、氨氮、亞硝酸鹽、攝食量及死亡情況等,養(yǎng)殖8周。實驗期間水溫為20.0~33.5 ℃,pH值為7.8~8.2,氨氮濃度<0.1 mg/L,亞硝酸鹽濃度<0.05 mg/L,光照為自然光源。
養(yǎng)殖實驗結(jié)束后停食24 h,記錄每缸魚尾數(shù),稱取總重,隨后每個缸隨機選取15尾魚用于采樣分析,其中3尾魚抹干體表水分放于封口袋內(nèi)于-20 ℃冰箱存放,用于全魚常規(guī)營養(yǎng)成分分析,12尾魚使用40 mg/L的MS-222溶液麻醉,隨后尾靜脈取血,抽血后6尾魚進行體長、體重測量,并于冰上解剖,測定其內(nèi)臟團重、腸重、肝臟重。尾靜脈采集的血液置于冷凍離心機中4 ℃下4 000 r/min離心10 min制備血清樣品,隨后分裝保存于-80 ℃冰箱中,用于抗氧化指標測定。
實驗飼料、全魚營養(yǎng)成分的測定方法如下:粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分、水分含量分別采用(GB/T6432-2018)、(GB/T6433-2006)、(GB/T6438-2007)、(GB/T6435-2014)進行測定;血清抗氧化指標采用試劑盒方法(南京建成生物工程研究所)測定。
特定生長率(SGR)=100%×[ln(實驗期末均重)-ln(實驗期初均重)]/實驗天數(shù);
增重率(WGR)=100%×(實驗期末均重-實驗期初均重)/實驗期初均重;
成活率(SR)=100%×實驗期末魚尾數(shù)/實驗期初魚尾數(shù);
飼料系數(shù)(FCR)=攝入飼料質(zhì)量/(末總重+死亡重-初始總重);
肥滿度(CF)=100×全魚體重(g)/[魚體長(cm)]3;
臟體比(VSI)=100%×內(nèi)臟重(g)/魚體重(g);
肝體比(HSI)=100%×肝臟重(g)/魚體重(g);
腸體比(ISI)=100%×腸重(g)/體重(g);
實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析,使用平均值±標準誤差(n=3)表示。分析前首先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗,若滿足正態(tài)分布和方差齊性則采用單因素方差分析(one-way ANOVA),差異顯著者再用Duncan檢驗方法進行多重比較;若不滿足方差齊性則采用Dunnett′s T3檢驗法進行多重比較,P<0.05表示差異顯著。
如表2可知,隨著β-葡聚糖添加量的增加,大口黑鱸末均重、WGR、SGR和SR升高,但組間差異不顯著,F(xiàn)CR隨添加量增加而降低。
表2 飼料中添加 β-葡聚糖對大口黑鱸生長性能的影響(n=3)
由表3可知,β-葡聚糖對大口黑鱸CF、VSI、HSI和ISI影響不顯著。
表3 飼料中添加β-葡聚糖對大口黑鱸形體指標的影響(n=18)
由表4可知,G1~G4組魚體粗蛋白和灰分含量高于G0組,粗脂肪含量低于G0組。G1、G2組粗蛋白含量顯著高于G0組,G3組粗脂肪含量顯著低于G0組,G4組灰分含量最高,顯著高于G0組。水分含量組間無顯著差異。
表4 飼料中添加β-葡聚糖對大口黑鱸體成分的影響(n=3)
如表5可知,G1~G4組血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性高于C0組,但差異不顯著。與G0組比較,G4組MDA含量顯著降低,抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基顯著升高。
表5 飼料中添加β-葡聚糖對大口黑鱸血清抗氧化能力的影響(n=3)
本研究顯示,β-葡聚糖提高大口黑鱸的末均重、增重率、特定生長率、存活率,降低飼料系數(shù),當添加量為0.12%時生長效果最佳,但與對照組差異不顯著,這可能與添加量未達到最大生長需要量有關(guān)。楊三峰等[12]發(fā)現(xiàn)酵母水解物、去除β-葡聚糖的酵母水解物和酵母培養(yǎng)物對大口黑鱸生長無促進作用,周萌等[13]也報道酵母水解物對大口黑鱸生長性能影響不顯著。但是有研究發(fā)現(xiàn)當飼料中酵母水解物添加量達到1.3%或1.5%時才可提高加州鱸的生長性能[14-15]。上述不同研究報道的酵母水解物對提高水產(chǎn)動物生長性能存在差異,主要原因可能與實驗所用酵母水解物來源、添加水平有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)酵母水解物富含核苷酸、β-葡聚糖和小肽等功能性成分,不同來源酵母水解物所含的功能成分存在較大差異,這可能影響酵母水解產(chǎn)物的促生長作用[15]。目前,雖然已經(jīng)證實β-葡聚糖能夠提高水產(chǎn)動物生長性能,但其作用機制尚不明確。有研究認為β-葡聚糖不直接參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝,其促生長作用可能與其免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)[16],適當劑量的β-葡聚糖可以在免疫調(diào)節(jié)方面起到積極作用促進生長,相反,當添加濃度過高時,大多數(shù)可消化的能量和蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到免疫功能中導致生長性能降低[17-18]。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)雖然β-葡聚糖屬于不可消化碳水化合物,但可以被腸道微生物利用,消化為具有生物活性的短鏈脂肪酸(SCFA)[19],此外β-葡聚糖具有增強腸道對營養(yǎng)代謝物消化吸收的能力,從而提高飼料有效利用率及養(yǎng)分的表觀消化率,加快動物生長發(fā)育[4,6,20]。LI等[21]研究發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖提高了芽孢桿菌(Bacillus)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的豐度,以及蛋白酶和淀粉酶的活性,對凡納濱對蝦具有促生長作用。在虹鱒中發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖改變了結(jié)構(gòu)蛋白的表達,這可能與虹鱒較高的生長速度有關(guān)[22]。肥滿度、臟體比、肝體比、腸體比是反映魚類生形體指標的重要參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖顯著提高亞東鮭幼魚的肥滿度,降低肝體比[6],但在對虹鱒的研究中卻發(fā)現(xiàn)0.2%β-葡聚糖顯著降低了肥滿度,提高了肝體比[23]。而本研究中未發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖對大口黑鱸形體指標有顯著的影響。
本研究發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖具有提高大口黑鱸全魚粗蛋白含量的作用。β-葡聚糖可誘導蛋白酶合成,提高飼料消化吸收能力,增強營養(yǎng)物質(zhì)積累,飼料中添加 0.02% 和0.04% 的β-葡聚糖顯著提高凡納濱對蝦粗蛋白含量[21],1.0%β-葡聚糖顯著提高奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus)胰蛋白酶活性和全魚粗蛋白含量[4]。研究表明β-葡聚糖顯著降低幼細鱗鯧(Piaractusmesopotamicus)血清甘油三酯含量以及肌肉、肝臟和內(nèi)臟團脂肪含量[24],降低奧尼羅非魚體脂肪沉積[4],上述結(jié)果與本研究發(fā)現(xiàn)的β-葡聚糖顯著降低大口黑鱸體脂肪含量的報道一致。研究認為動物一般不具備自身合成β-葡聚糖酶的能力,因此攝入的β-葡聚糖不能被分解,只能以營養(yǎng)纖維的形式被動物吸收,這些被吸收的纖維具有降低血脂和膽固醇的作用。β-葡聚糖有助于脂肪酸代謝改變,腸道細菌發(fā)酵β-葡聚糖產(chǎn)生短鏈脂肪酸,這些脂肪酸被吸收并抑制肝臟膽固醇的合成,具有降血脂作用[25-26]。雖然已有β-葡聚糖的降脂作用的研究報道,但關(guān)于β-葡聚糖如何作用于脂代謝途徑,相關(guān)的分子機制如何仍需要開展進一步的研究工作。本研究中大口黑鱸全魚灰分含量隨著β-葡聚糖的添加量增加而升高,當添加量為0.12%時顯著高于對照組。目前關(guān)于β-葡聚糖改變機體灰分沉積的報道并不多,雖然在奧尼羅非魚和黃顙魚中發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖有提高全魚灰分含量的作用,但差異并未達到顯著水平[4,27]。而在生長育肥豬的研究發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖顯著提高干物質(zhì)以及鈣和磷養(yǎng)分的消化率[28]。
β-葡聚糖能夠清除動物體內(nèi)的自由基,提高抗氧化能力,減少對機體的氧化損傷。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和(過氧化氫酶)CAT是魚體主要的酶促抗氧化防御系統(tǒng),SOD可以將O2-·轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2,H2O2在GSH-Px作用下進一步催化分解,從而實現(xiàn)將自由基清除,而丙二醛含量則可以作為間接反映機體氧化損傷程度的一個重要指標。研究表明,β-葡聚糖顯著提高海鱸SOD酶活性、總抗氧化能力,降低丙二醛含量[1];提高真鯛(Pagrusmajor)血清CAT酶活性[29]以及彭澤鯽(Carassiusauratusvar Pengze)腸道組織抗氧化能力[30]。β-葡聚糖激活Nrf2信號通路,上調(diào)過CAT、Cu-Zn SOD等基因表達,提高草魚抗氧化能力[31]。在脅迫條件下,β-葡聚糖增強抗氧化能力的作用更為顯著,例如β-葡聚糖提高大黃魚抗氧化能力,增強耐低氧能力[32],增強感染嗜水汽單胞菌(Aeromonassalmonicida)虹鱒的抗氧化能力,清除由細菌引起的過量ROS等[8]。本實驗中在β-葡聚糖添加量為0.12%時血清丙二醛含量顯著降低,抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基能力顯著升高,說明β-葡聚糖顯著提高大口黑鱸的抗氧化能力。