劉 娟，袁林聰，李偉斌，白壽有，李進榮，蔡實旺，尹馨玉，孔令富，武祥偉

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 361021；2.元江縣魚種技術(shù)推廣站，云南元江 653300)

我國具有豐富的鯉種質(zhì)資源和悠久的養(yǎng)殖歷史，鯉亞科魚類區(qū)系遠(yuǎn)較其他國家豐富，地方種多達(dá)23種，其中分布于云南的鯉亞科魚類多達(dá)4屬18種，云南高原特有種多達(dá)12種[1-4]。杞麓鯉(Cyprinuscarpiochilia)即是其中一種，主要分布于云南境內(nèi)高原湖泊中，是我國普通鯉(C.carpioLinnaeus)四大亞種之一[2]，在上世紀(jì)六七十年代它是星云湖、杞麓湖等湖泊中的主要經(jīng)濟魚類與捕撈對象[3,5]。云南高原特有魚類生境相對狹窄，對原生境依賴性高，生境變化對它們的生存影響較大。近年來云南高原湖泊外來魚類入侵、水質(zhì)污染以及資源和環(huán)境過度利用等致使土居種或地方特有種種群數(shù)量急劇減少，種質(zhì)資源退化、外來魚類基因漸滲等問題日益突出[6-8]。因此，在本世紀(jì)初云南境內(nèi)漁業(yè)相關(guān)單位以撫仙湖及其水系中的野生種為基礎(chǔ)群體，開展了杞麓鯉種質(zhì)資源保存工作，在杞麓鯉人工繁殖方面取得了突破[9-10]，但保種群體的遺傳結(jié)構(gòu)尚不清楚，不利于種群后續(xù)保種與提純復(fù)壯。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記是廣泛分布于基因組中的簡單串聯(lián)重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSR)，基于DNA變異而呈現(xiàn)豐富的多態(tài)性，并且它還具有數(shù)量多、通用性好，易于操作等特點[11-13]，被廣泛運用于水產(chǎn)動物的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)資源遺傳監(jiān)測、遺傳圖譜構(gòu)建和分子輔助育種等方面[14-15]。本研究從杞麓鯉基因組序列中篩選了多態(tài)性高的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，使用這些分子標(biāo)記對杞麓鯉保種群體進行遺傳變異研究，評價保種群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平，以期為杞麓鯉種質(zhì)資源保護與提純復(fù)壯提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

杞麓鯉為玉溪市江川區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站養(yǎng)殖基地保種至第四代群體，為2齡個體且均已性成熟，體重(1 198.70±371.64) g，體長(35.90±5.08) cm。隨機選取40尾個體，剪取鰭條組織，使用無水乙醇固定并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA抽提

采用傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇法[16]進行基因組DNA提取，純化后稀釋至50 ng/μL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星位點的開發(fā)

使用GMATA 2.0程序[17]從杞麓鯉基因組序列中查找SSR位點并設(shè)計PCR引物，經(jīng)PCR擴增驗證后從中隨機選取15個多態(tài)性高的SSR位點用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析(表1)。

表1 杞麓鯉15對微衛(wèi)星引物序列與特征

1.4 PCR擴增與電泳

PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中PCR mix(Takara，大連寶生物工程有限公司) 8 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 1.2 μL。PCR反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58或60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)固定、銀染、顯色后，統(tǒng)計SSR等位基因條帶數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用popgene32 v1.32軟件[18]分析群體的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Shannon′s信息指數(shù)(I)，使用FSTAT v2.9軟件[19]計算SSR位點的多態(tài)信息含量(PIC)、固定指數(shù)(Fis)、Nei′s遺傳距離(D)，并進行哈代-溫伯格平衡(HWE)χ2檢驗。

使用Bottleneck v1.2.02軟件[20]采用兩種方法評估群體瓶頸效應(yīng)，一是雜合度過剩檢驗，基于無限等位基因突變模型(Infinite allele model,IAM)、雙相突變模型(Two-phased model of mutation,TPM)和逐步突變模型(Stepwise mutation model,SMM)計算群體平均期望雜合度(Heq)，Heq與根據(jù)等位基因頻率計算的He比較，使用標(biāo)記檢驗(sign test)和標(biāo)記秩檢驗(wilcoxon sign-rank test)對雜合度過剩與否進行顯著性檢測；二是分析等位基因頻率分布，在平衡群體中等位基因頻率分布柱狀圖呈“L”形，而經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)的群體，等位基因頻率發(fā)生遷移，偏離平衡狀態(tài)下的“L”形分布[21]。根據(jù)Nei′s遺傳距離使用MEGA 10.1軟件包[22]構(gòu)建杞麓鯉群體的系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹(neighbor-joining,NJ)，設(shè)置Bootstrap 1 000次重復(fù)抽樣檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

在杞麓鯉群體中15個SSR位點均能特異性擴增(圖1)，共監(jiān)測到117個等位基因，平均等位基因數(shù)為7.8個/位點，有效等位基因數(shù)為3.2～8.9個，平均值為5.8個/位點；期望雜合度為0.696 4～0.900 0，平均值為0.824 4；多態(tài)信息含量PIC為0.647 6～0.877 0；其中2個SSR位點屬于中度多態(tài)(0.5

圖1 杞麓鯉1～24個體微衛(wèi)星分子標(biāo)記聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗

Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果表明10個SSR位點偏離平衡狀態(tài)，其中8個位點極顯著偏離平衡。SSR位點YJL057與YJL073的近交系數(shù)Fis小于0，表現(xiàn)雜合子過剩，其余13個位點的Fis值位于0.054 3～0.634 7之間，表現(xiàn)雜合子缺失，保種群體的近交系數(shù)Fis均值為0.237 1，近交系數(shù)較高，群體內(nèi)個體間存在一定程度的近交(表2)。

表2 杞麓鯉保種群體的遺傳多樣性參數(shù)與F-統(tǒng)計量

續(xù)表2

2.3 群體瓶頸效應(yīng)分析

基于IAM、TPM和SMM的假設(shè)計算了杞麓鯉保種群體在3種突變模型下的期望雜合度(He)與平均期望雜合度(Heq)的差異程度，在IAM假設(shè)下，11個SSR位點的He顯著大于Heq；在TPM假設(shè)下，7個SSR位點的He顯著大于Heq；在SMM假設(shè)下，4個SSR位點的He顯著大于Heq，均表明保種群體在這些SSR位點上偏離了突變-漂移平衡，保種群體經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)。

使用Sign test標(biāo)記檢驗和Wilcoxon test標(biāo)記秩檢驗分別對上述3種突變模型下種群瓶頸效應(yīng)進行檢測，結(jié)果表明在3種突變模型下保種群體均顯著偏離突變-漂移平衡(P<0.05)，表現(xiàn)為極顯著的雜合過剩，杞麓鯉保種群體經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)(表4)。

表4 杞麓鯉保種群體瓶頸效應(yīng)檢測

15個SSR位點的等位基因頻率為0.012 5～0.486 5，YJL048與YJL066位點等位基因頻率呈典型的“L”形分布，其他13個位點等位基因頻率呈現(xiàn)由低頻(<0.100 0)向高頻遷移，偏離了平衡狀態(tài)下的“L”形分布，表明杞麓鯉保種群體經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)(圖2)。

圖2 杞麓鯉保種群體15個微衛(wèi)星位點等位基因頻率分布

2.4 個體間遺傳距離和聚類分析

杞麓鯉保種群體40個個體兩兩間的Nei′s遺傳距離(D)為0.244 8～0.966 7，其中D<0.5、0.5≤D<0.7、0.7≤D<0.8與D≥0.8的兩兩組合比例分別為0.90%、34.49%、39.62%與25.00%，主要分布于0.5～0.8之間。NJ聚類樹表明40個個體具有共同的根，再進一步聚類為2支，包含的個體數(shù)分別為7個和33個，33個個體又聚類為2支(圖3)。

圖3 杞麓鯉保種群體40個個體的NJ聚類樹

3 討論

3.1 保種群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是評價種質(zhì)資源的重要參數(shù)，人工保種或選育群體經(jīng)常發(fā)生近交和遺傳漂變，因此高的群體遺傳多樣性對優(yōu)良性狀的穩(wěn)定和延續(xù)至關(guān)重要[23]。等位基因數(shù)、雜合度與多態(tài)信息含量PIC均是評價群體遺傳多樣性的重要參數(shù)。當(dāng)群體雜合度在0.5～0.8時，即可認(rèn)為該群體具有較高的多樣性，而PIC>0.5時即被認(rèn)為高度多態(tài)性[24-25]。因此，杞麓鯉保種群體的遺傳多樣性水平較高。中國鯉種類豐富，保種群體的遺傳多樣性普遍較高，例如黃河鯉群體(C.carpiohacmalopterus)的Ne為7.83，He為0.88，PIC為0.85，黑龍江鯉(C.carpioamurensis)保種群體的Ne為7.68，He為0.87，PIC為0.84[26]，它們的遺傳多樣性水平高于杞麓鯉；而建鯉(C.carpiovar.Jan)群體的He為0.757 0，PIC為0.725 3[27]，福瑞鯉(C.carpiovar.FFRC)群體的Ne為4.77，He為0.78，PIC為0.73[28]，松浦鯉(C.carpiovar.Songpu)群體的Ne為4.285 2，He為0.751 5[29]，他們的遺傳多樣性水平低于杞麓鯉，因此與之相比在主要鯉魚種群中杞麓鯉保種群體的遺傳多樣性水平處于中等。

3.2 保種群體的遺傳結(jié)構(gòu)

杞麓鯉保種群體中Na遠(yuǎn)大于Ne，表明群體中等位基因分布均勻度較低，存在種群規(guī)模變小且有效等位基因丟失現(xiàn)象，而群體的等位基因頻率主要集中于小于0.200 0的區(qū)間，也與上述推斷相符合。物種進化過程中為了增加對生活環(huán)境的適應(yīng)能力會積累較多低頻率稀有等位基因(<0.100 0)，而群體經(jīng)歷遺傳瓶頸效應(yīng)后等位基因頻率的分布由低頻(<0.100 0)轉(zhuǎn)移到中頻(0.100 0～0.200 0)，從而偏離種群在突變-漂變平衡狀態(tài)下的“L”形分布。因此杞麓鯉保種群體的低頻率等位基因(<0.100 0)減少、中頻率等位基因(0.100 0～0.200 0)增加，表明保種群體受到了選擇壓力、經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)[21]；此外，在IAM、TPM、SMM三種突變模型下兩種假設(shè)檢驗均檢測到了杞麓鯉保種群體經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)，表明上述選擇壓力來自瓶頸效應(yīng)。因此，在Hardy-Weinberg平衡的χ2檢驗中67%的SSR位點極顯著偏離平衡狀態(tài)。近親交配、等位基因突變等產(chǎn)生較多的純合體，均可導(dǎo)致SSR位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡[27]，這些偏離的位點極有可能是因為杞麓鯉保種群體小，發(fā)生了近親交配，導(dǎo)致較多位點純合及雜合體缺失[30]。此外，樣本容量偏小也是導(dǎo)致較多SSR位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡的原因之一。近交系數(shù)Fis衡量亞群內(nèi)的非隨機交配引起的個體雜合度降低[31]，杞麓鯉保種群體的13個SSR位點的Fis值均為正數(shù)，表明保種群體雜合子缺失。當(dāng)Fis>0，則Ho

綜上所述，杞麓鯉保種群體仍具有較高的遺傳多樣性水平，但保種過程中的人工選擇壓力對保種群體產(chǎn)生了顯著影響，群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，表現(xiàn)為群體等位基因分布不均、雜合子缺失或有效等位基因丟失、多數(shù)SSR位點偏離Hardy-Weinberg平衡等現(xiàn)象，保種群體經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)，并且存在一定程度的近交。因此，在保種過程中應(yīng)補充原種個體以擴大群體規(guī)模。