榮 華，張 雷，王曉雯，武祥偉，王金浩，胡 青，畢保良，孔令富，豆騰飛

(1．襄陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北襄陽(yáng) 441050；2．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3．云南華衡檢測(cè)技術(shù)有限公司，昆明 650201)

食性是魚(yú)類在進(jìn)化過(guò)程中，依其生存環(huán)境和餌料生物來(lái)源逐漸形成的食物偏好習(xí)性[1-2]。魚(yú)類食性以進(jìn)食方式和食物內(nèi)容劃分為植物食性、動(dòng)物食性、雜食性及濾食性[3]。魚(yú)類的食性受到諸多因素的影響，不僅與內(nèi)在遺傳和生理因素如食欲、攝食器官、消化道結(jié)構(gòu)、消化酶活性有關(guān)，還與外在的餌料生物、環(huán)境及消化道微生物等有關(guān)[4]。許多魚(yú)類從幼魚(yú)生長(zhǎng)至成魚(yú)，都會(huì)發(fā)生一定的食性轉(zhuǎn)變，如草魚(yú)幼魚(yú)期食性經(jīng)歷三個(gè)階段：浮游動(dòng)物食性階段、食性轉(zhuǎn)變階段和草食性階段[5]，諸多因素的存在增加了魚(yú)類食性界定難度。而判定魚(yú)類食性是研究魚(yú)類營(yíng)養(yǎng)學(xué)的基礎(chǔ)，對(duì)研制魚(yú)類飼料和科學(xué)投喂具有重要意義。

魚(yú)類食性與其腸道消化酶活性密切相關(guān)，如HIDALGO等[6]研究發(fā)現(xiàn)鰻鱺(Anguillajaponica) 的淀粉酶活性比虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的高；草食性和雜食性魚(yú)類的淀粉酶活性要高于肉食性魚(yú)類[7]。魚(yú)類的食性也與消化器官的發(fā)育及機(jī)能、腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)選取草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)、鱖(Sinipercachuatsi)、滇池高背鯽(Carassiusauratus)、昆明裂腹魚(yú)(Shizothoraxgrahami)分別作為草食、肉食、雜食和濾食性魚(yú)類代表，通過(guò)分析魚(yú)類食性與腸道結(jié)構(gòu)和消化酶活性的關(guān)系，評(píng)價(jià)不同食性魚(yú)類對(duì)各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用潛力，為合理配置飼料、科學(xué)投喂提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及樣品采集

本實(shí)驗(yàn)所采用的草魚(yú)(1 323.6±40.20) g、鱖(841.3±34.54) g、滇池高背鯽(350.4±25.98) g、昆明裂腹魚(yú)(471.1±23.94) g,均捕撈于云南滇池及附近水域，并運(yùn)至云南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)，所有魚(yú)在水泥池暫養(yǎng)12 d，期間投喂實(shí)驗(yàn)室自備暫養(yǎng)飼料，飼料配方見(jiàn)表1，每種魚(yú)隨機(jī)選擇10尾，將新鮮活魚(yú)經(jīng)麻醉劑(40 mg/L丁香酚)浸泡后，每個(gè)品種隨機(jī)挑選3尾魚(yú)存于4 ℃冰箱中，用于后續(xù)體成分分析；再隨機(jī)挑選3尾魚(yú)用于血液樣本的采集，利用尾靜脈采血法抽取血液后，靜置低溫離心(3 000 r/min，10 min，4 ℃)，分離取上層淡黃色液體即為血清，分離的血清樣品置于-20 ℃冰箱中保存，直至后續(xù)檢測(cè)；最后選取3尾魚(yú)進(jìn)行解剖，取肝胰腺及腸道組織樣品，保存于-20 ℃冰箱用于消化道酶活測(cè)定；剩下的1尾魚(yú)，解剖取小腸用于組織切片觀察，盡量剔除小腸外壁脂肪，取出前腸(幽門(mén)盲囊后0.5 cm處)，分成小塊(1cm×1cm)固定于Bouin′s(波恩氏)液中。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方和營(yíng)養(yǎng)組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2)維生素預(yù)混劑(mg/kg)：維生素A，12；維生素B12，0.1；維生素C，150；維生素D3，5，維生素E，80；維生素K3，10；肌醇，80；泛酸，30；煙酸，100；葉酸，12；生物素，0.8；乙氧喹，80。

1.2 近似成分分析

全魚(yú)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量依照Association of Official Analytical Chemists(AOAC，1995)建立的方法進(jìn)行測(cè)定[10]。簡(jiǎn)要敘述如下：水分在干燥后用重量法測(cè)定，樣品置于烘箱(FUMA DGX-8053B，上海)中105 ℃烘至恒重；粗蛋白利用凱氏定氮法測(cè)定，使用凱氏定氮自動(dòng)取樣系統(tǒng)1035分析儀(Hoganas，Sweden)測(cè)定蛋白(N=6.25)；采用脂肪提取系統(tǒng)SZF-06A(上海新家儀器有限公司)，用石油醚萃取法測(cè)定粗脂肪含量。粗灰分利用燃燒法測(cè)定，將樣品置于馬弗爐(Carbolite CWF 11/5，Hope Valley，UK)內(nèi)550 ℃燃燒12 h以上，直至燃燒完全成白色粉末。

1.3 血液生化指標(biāo)測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)涉及的所有血清生化指標(biāo)，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(AIB)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CH)和總蛋白(TP)，使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒(試劑盒貨號(hào)分別為：C010-2、C009-2、A028-2、C009-2、A110-1、A110-1、A045-4)，參考說(shuō)明書(shū)依步驟對(duì)樣品進(jìn)行前處理，然后在全波段掃描酶標(biāo)儀(Tecon，Australia)上測(cè)定吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算公式得到各指標(biāo)的濃度。

1.4 消化酶活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝胰腺及腸道中的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及粗酶液中的總蛋白的測(cè)定使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒(試劑盒貨號(hào)分別為：A080-2、A054-1、C016-2、A045-2)，參考說(shuō)明書(shū)依步驟對(duì)樣品進(jìn)行前處理，然后在紫外分光光度計(jì)UV-5200(上海元儀器有限公司，中國(guó))上測(cè)定蛋白酶樣品的吸光度(OD值)，在可見(jiàn)分光光度計(jì)V-5000H(上海元儀器有限公司，中國(guó))上測(cè)定脂肪酶和淀粉酶。檢測(cè)樣品反應(yīng)液的顏色深淺與樣品中消化酶活性呈正相關(guān)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。利用試劑盒說(shuō)明書(shū)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定粗酶液中的總蛋白濃度。

1.5 腸道組織形態(tài)

經(jīng)過(guò)波恩氏液固定后的腸道樣品依次通過(guò)脫水—透明—浸蠟—包埋—切片—烤干等步驟，制成組織切片，然后經(jīng)過(guò)HE染色，主要用蘇木素染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，最后脫水封片，利用電子生物顯微鏡KOPPACE 40X-1600X(科普艾斯科技有限公司，深圳)觀察，染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)紅色。利用Case Viewer 軟件對(duì)前腸組織褶皺高度、褶皺寬度和肌層厚度分別進(jìn)行測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用分析軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；利用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)食性操縱的主效應(yīng)，通過(guò)Tukey多重比較確定各實(shí)驗(yàn)組間的差異顯著水平，P<0.05為差異顯著；用Origin 75 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種不同食性魚(yú)類體近似成分比較分析

本實(shí)驗(yàn)分析計(jì)算出草魚(yú)、昆明裂腹魚(yú)、鱖和滇池高背鯽四種魚(yú)的體近似成分(表2)。結(jié)果顯示，肉食性鱖魚(yú)體水分含量最低，而蛋白含量最高，并達(dá)到顯著水平；濾食性昆明裂腹魚(yú)魚(yú)體粗脂肪含量要顯著高于其他三種魚(yú)類，而灰分含量顯著低于其他三種魚(yú)類；雜食性滇池高背鯽魚(yú)體粗蛋白和粗脂肪含量最低，而水分和灰分含量最高?？偟膩?lái)說(shuō)，魚(yú)體近似成分受到魚(yú)類品種(食性)的顯著影響。

表2 四種魚(yú)類的近似成分比較分析

2.2 四種不同食性魚(yú)類血液生化指標(biāo)比較分析

血液生化指標(biāo)是反映機(jī)體代謝水平和健康狀況的內(nèi)在“指示劑”，本研究測(cè)定分析了四種魚(yú)類血液生化指標(biāo)的差異。如表3所示，血液生化指標(biāo)中GOT、AIB、TG、TCH受品種(食性)的影響顯著。其中，肉食性鱖的GOT、TG、TCH顯著高于其他三種魚(yú)類；草食性魚(yú)類AIB最高，顯著高于其他三種魚(yú)類。另外，血液中GPT、ALP、TP水平較為穩(wěn)定，基本不受品種(食性)的影響。

表3 四種魚(yú)類的部分血液生化參數(shù)比較分析

2.3 四種不同食性魚(yú)類消化酶比較分析

由圖1可見(jiàn)，鱖的胰蛋白酶和胰脂肪酶活性最高，鱖的胰淀粉酶活性最低，顯著高于(低于)其他三種魚(yú)。草魚(yú)與滇池高背鯽的胰蛋白酶和胰脂肪酶活性顯著低于鱖和昆明裂腹魚(yú)，而草魚(yú)和昆明裂腹魚(yú)胰淀粉酶活性顯著高于鱖和滇池高背鯽。由圖2可見(jiàn)，鱖的腸蛋白酶活性最高，腸淀粉酶活性最低，顯著高于(低于)其他三種魚(yú)類。昆明裂腹魚(yú)腸脂肪酶活性最低，顯著低于其他三種魚(yú)類。草魚(yú)和滇池高背鯽的腸脂肪酶和腸淀粉酶顯著高于昆明裂腹魚(yú)和鱖。

圖1 四種魚(yú)類肝胰腺消化酶活性

2.4 四種不同食性魚(yú)類腸道形態(tài)學(xué)比較分析

四種魚(yú)類腸道組織形態(tài)學(xué)觀察見(jiàn)圖3和表4，由圖3可知，四種魚(yú)的絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度均存在顯著差異?？紤]到四種魚(yú)的體型、體重存在較大差異，我們利用絨毛高度指數(shù)、絨毛寬度指數(shù)和肌層厚度指數(shù)削弱體重對(duì)腸道形態(tài)的影響(表4)，結(jié)果表明：絨毛高度指數(shù)、絨毛寬度指數(shù)和肌層厚度指數(shù)在四種魚(yú)之間仍然差異顯著，具體表現(xiàn)為絨毛高度指數(shù)：草魚(yú)>鱖>昆明裂腹魚(yú)>滇池高背鯽魚(yú)；絨毛寬度指數(shù)和肌層厚度指數(shù)：鱖>草魚(yú)>滇池高背鯽魚(yú)>昆明裂腹魚(yú)。另外，由圖3可見(jiàn)，四種魚(yú)腸道形態(tài)各具特點(diǎn)，差異較大。如鱖腸道微絨毛分支較多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，如按微絨毛復(fù)雜程度排序可為：鱖>草魚(yú)>昆明裂腹魚(yú)>滇池高背鯽魚(yú)。

表4 四種魚(yú)類的腸絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度的比較分析

圖3 四種魚(yú)類腸道組織形態(tài)

3 討論

魚(yú)類的食性直接影響其食物組成，而通過(guò)分析食物組成也成為判定魚(yú)類食性最直接有效的方法[11]。魚(yú)體組織中的近似成分分析直接反映了其餌料組成[12]，因此對(duì)魚(yú)類食性的判定具有一定的輔助作用。目前關(guān)于昆明裂腹魚(yú)的研究相對(duì)較少，對(duì)其食性一直沒(méi)有準(zhǔn)確的判定。李國(guó)治等[13]報(bào)道魚(yú)體大小及發(fā)育階段對(duì)昆明裂腹魚(yú)食性影響較大，如在幼魚(yú)和稚魚(yú)期以浮游動(dòng)物為主，其食性為雜食偏動(dòng)物食性，而成魚(yú)階段屬于雜食偏植物食性，主要以浮游植物和藻類為主，特別是裂腹魚(yú)下顎前緣有銳利的角質(zhì)，利于舔刮石塊上固著的藻類。本研究發(fā)現(xiàn)鱖中粗蛋白含量顯著高于其他三種魚(yú)類，這也間接印證了鱖的食肉特性。而昆明裂腹魚(yú)和滇池高背鯽中粗蛋白含量介于草魚(yú)和鱖之間，間接判定昆明裂腹魚(yú)和滇池高背鯽屬于雜食性魚(yú)類。另外，昆明裂腹魚(yú)食性受季節(jié)和環(huán)境中餌料生物的組成影響也較大，諸多因素都導(dǎo)致明裂腹魚(yú)食性比較復(fù)雜，較難鑒定，需要結(jié)合更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析[14-15]。血液生化參數(shù)是反映動(dòng)物機(jī)體新陳代謝及其健康狀況的重要指標(biāo)，也是動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收利用最直接的指示[16-17]，還是不同食性魚(yú)類利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)潛力的間接反映。本研究對(duì)四種魚(yú)類血液生化指標(biāo)進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)血液生化指標(biāo)中GOT、AIB、TG、TCH受到品種(食性)的顯著影響。GOT在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起重要作用，測(cè)定血清GOT活性可以反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝水平和肝細(xì)胞的功能狀況[17]。本研究發(fā)現(xiàn)血清GOT活性在四種魚(yú)中從高到低依次為：鱖、滇池高背鯽、昆明裂腹魚(yú)、草魚(yú)。TG由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，又稱中性脂肪，在體內(nèi)主要起供能作用；血清TCH包含血液所有的游離膽固醇和膽固醇酯，血清TG和TCH是脂代謝的重要指標(biāo)[18]。本研究中鱖血清TG和TCH均顯著高于其他三種魚(yú)，昆明裂腹魚(yú)和滇池高背鯽依次介于其中，而草魚(yú)血清中TG和TCH含量最低，表明鱖脂質(zhì)代謝水平最旺盛，而草魚(yú)相對(duì)較弱。綜上表明血液生化指標(biāo)與魚(yú)類食性相適應(yīng)，如鱖屬肉食性特性，草魚(yú)植物食性，所以鱖脂質(zhì)代謝較草魚(yú)旺盛。血液生化指標(biāo)雖然能反映魚(yú)類營(yíng)養(yǎng)吸收及生理狀況，對(duì)魚(yú)類食性的鑒定具有很好的輔助作用，但血液生化指標(biāo)會(huì)受到諸多因素的影響，如環(huán)境，應(yīng)激，性別及魚(yú)類發(fā)育階段等[19-20]，因此還需要借助一些更有效、更直接的手段幫助鑒定魚(yú)類食性。

魚(yú)類的食性是與其消化器官的組織結(jié)構(gòu)和消化機(jī)能相適應(yīng)的，如潘黔生等[21]對(duì)6種有胃真骨魚(yú)類消化系統(tǒng)進(jìn)行了比較解剖研究，口裂大小、咽齒的發(fā)達(dá)與否，胃的存在與否以及腸道的長(zhǎng)短等均與食性有密切的關(guān)系。鱖是有胃魚(yú)的代表，草魚(yú)和滇池高背鯽屬于典型的無(wú)胃魚(yú)，昆明裂腹魚(yú)食道與腸道之間有一個(gè)膨大狀的囊腔，具有分泌消化液，行使胃的部分功能。魚(yú)類食性與消化酶活性也是有一定相關(guān)性的，食性不同，消化器官組織結(jié)構(gòu)，其消化機(jī)能明顯不一樣，導(dǎo)致消化酶活性也有明顯差異[22-23]。如不同食性魚(yú)類對(duì)飼料中碳水化合物的利用不用，雜食性魚(yú)類較肉食性魚(yú)類可利用更高水平的碳水化合物[24]。本研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶、腸蛋白酶和胰脂肪酶活性大致表現(xiàn)為肉食性>雜食性>草食性。一些學(xué)者也報(bào)道了相似結(jié)果，劉運(yùn)正等[25]報(bào)道蛋白酶活性與食性有關(guān)，肉食性魚(yú)類的蛋白酶活性顯著高于雜食性和草食性。PARRIZAS等[26]指出，一般肉食性魚(yú)類的脂肪酶活性要高于草食性和雜食性魚(yú)類。本實(shí)驗(yàn)中草魚(yú)和滇池高背鯽的腸脂肪酶活性高于鱖和昆明裂腹魚(yú)，可能因?yàn)榍罢邔儆跓o(wú)胃魚(yú)，因此腸道需要行使部分胃的功能，所以導(dǎo)致腸脂肪酶活性較高。李向松等[27]比較了草魚(yú)、異育銀鯽和青魚(yú)淀粉酶的差異后指出，草食性草魚(yú)和肉食性青魚(yú)對(duì)玉米淀粉的利用要優(yōu)于雜食性異育銀鯽。劉泓宇等[28]報(bào)道了雜食性魚(yú)類的淀粉酶活性要高于肉食性魚(yú)類。本研究也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果，草魚(yú)的胰淀粉酶和腸淀粉酶活性最高，而鱖的最低。另外，腸道是魚(yú)類機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要器官，特別是對(duì)一些無(wú)胃魚(yú)，其消化作用更加突出。不同食性魚(yú)類腸道各部形態(tài)結(jié)構(gòu)上各具特點(diǎn)，如肉食性魚(yú)類腸道較短，雜食性魚(yú)類腸道較長(zhǎng)，草食性魚(yú)類介于之間[23]。劉懷如等[29]對(duì)南方胡子鲇的消化系統(tǒng)進(jìn)行解剖觀測(cè)，其消化系統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與食性相適應(yīng)的特點(diǎn)。本研究也發(fā)現(xiàn)四種食性魚(yú)類腸道組織形態(tài)各異，腸絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度在四種魚(yú)類之間均存在顯著差異。鱖腸道微絨毛分支較多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，按微絨毛復(fù)雜程度(絨毛長(zhǎng)度和絨毛寬度)排序可為：肉食性>草食性>雜食性。肌層厚度也與腸道微絨毛復(fù)雜程度一致，肉食性>草食性>雜食性。腸道的特殊結(jié)構(gòu)決定了腸道是魚(yú)體容納食物、運(yùn)輸食物以及消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所，腸微絨毛高度、寬度及其復(fù)雜程度直接影響腸道的容納性及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[30]。腸道壁肌肉層由平滑肌組成，通過(guò)節(jié)律性舒張和收縮來(lái)推動(dòng)食物在腸道內(nèi)移動(dòng)，肌層厚度直接反映腸道的收縮蠕動(dòng)能力，加強(qiáng)腸道收縮蠕動(dòng)是增加食物消化和降低食糜流通的有效手段[31]。肉食性魚(yú)類腸道較短，通過(guò)增加腸道結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，可以降低食糜的流通速度，增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。因此，腸道結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性與腸道長(zhǎng)度呈現(xiàn)相反的結(jié)果，并與魚(yú)類食性相適應(yīng)，達(dá)到對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分吸收的目的。

綜上所述，魚(yú)體組成、血液生化指標(biāo)、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及消化道酶活受食性的顯著影響，且各指標(biāo)與魚(yú)類食性相適應(yīng)。如肉食性魚(yú)類腸道雖短，但其形態(tài)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，且其蛋白酶、脂肪酶活性相對(duì)較高，草食性魚(yú)類剛好相反，分析這些規(guī)律對(duì)魚(yú)類的食性鑒定具有很好的輔助作用。與畜禽相比，魚(yú)類的機(jī)械消化能力很差，特別是一部分無(wú)胃魚(yú)，消化功能的強(qiáng)弱很大程度上取決于消化酶活性。因此，研究魚(yú)類不同食性及其獨(dú)特的消化生理，根據(jù)魚(yú)類食性特點(diǎn)合理配制飼料，對(duì)提高飼料利用促進(jìn)魚(yú)類生長(zhǎng)具有重要意義。