孟勝喜，陳慧澤，鄧楚珺，孟澤宇

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院，上海 200233；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

據(jù)估計，目前全世界有5 000萬人患有癡呆癥[1]，其中阿爾茨海默病(AD)占60%～80%，顯著增加了照顧負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[2-4]。隨著老齡化人口的快速增長，AD的患病率呈逐年上升趨勢，世界衛(wèi)生組織宣布AD已經(jīng)成為亟待解決的全球公共衛(wèi)生問題。AD的特點是記憶力和認(rèn)知能力進行性下降，最終影響到其日常活動能力和和自主功能[5]。截至目前,尚無AD治療特效藥。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)，梓醇-川芎嗪方可以有效改善AD模型小鼠的認(rèn)知障礙[6]。目前研究證實，神經(jīng)炎癥伴隨著AD的發(fā)生與發(fā)展[7]。為了進一步探討梓醇-川芎嗪方對APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶行為及炎性因子的影響，故開展本實驗。

1 實驗材料與方法

1.1動物 3月齡SPF級雄性APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠50只，3月齡C57BL/6J野生型雄性小鼠10只，體重(23±3)g，均購自南京大學(xué)模式動物研究所，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-(蘇)2018-0008。全部小鼠在上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司動物房單籠預(yù)飼養(yǎng)2周，光照/黑暗：12 h/12 h，隨意飲水和進食，溫度(22±2)℃,相對濕度(60±5)%,12 h光照。該實驗經(jīng)上海市第六人民醫(yī)院動物倫理福利委員會批準(zhǔn)(DWLL2022-0453)。

1.2藥物 梓醇-川芎嗪方由梓醇4.274 mg和川芎嗪1.554 mg組成。梓醇CAS 編號：2415-24-9，分子式：C15H22O10，分子量為362.33，純度≥98.0%,上海滬崢生物科技有限公司提供，批號：DSTDZ000502。川芎嗪CAS 編號：1124-11-4，分子式：C8H12N2，分子量為136.19，純度≥98.0%，上海滬崢生物科技有限公司提供，批號：DST200602-032。鹽酸多奈哌齊(安理申)，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050978，批號：1705080，規(guī)格：5 mg/片。

1.3儀器與試劑 實驗Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司生產(chǎn)，型號：JLBehv-MWMG-1)；全自動化學(xué)發(fā)光儀(Tanon-6100)。白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、β淀粉樣蛋白(Aβ)、Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白(p-Tau)ELISA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.4實驗方法 將50只SPF級APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠隨機分為5組，每組10只。將10只同月齡C57BL/6J野生型雄性小鼠作為正常組。依據(jù)人和動物體表面積折算系數(shù)換算[8]給藥量，梓醇-川芎嗪方低、中、高劑量組分別給予25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg梓醇-川芎嗪方灌胃，安理申組給予安理申溶液5 mg/kg灌胃，正常組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，均每天1次，連續(xù)灌胃8周。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力 干預(yù)7周后，采用Morris水迷宮實驗評估小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮有4個象限，在第3象限中央置平臺，保持水溫22 ℃左右，接入圖像采集系統(tǒng)。實驗前1 d對小鼠進行適應(yīng)性訓(xùn)練。池內(nèi)注水，水位要高于平臺1 cm，并倒入奶粉隱藏平臺，于第1，2，4象限水池中點隨機面壁放入小鼠，記錄小鼠找到并爬上平臺的時間，即逃避潛伏期，連續(xù)記錄5 d。第6天，撤掉平臺，第1象限中點面壁放入小鼠，記錄120 s內(nèi)小鼠穿越原平臺次數(shù)。

1.5.2小鼠對新物體的偏好指數(shù) 采用新物體識別測試方法進行，該測試分為適應(yīng)期、訓(xùn)練期和測試期三部分[9]。在適應(yīng)期里，將每只小鼠置于箱內(nèi)10 min；在訓(xùn)練期里，將A1、A2相同的物體放入到以上的箱內(nèi)，讓小鼠在箱子里面活動10 min；在測試期里，將A2換成 B1(A、B兩物體是相似的)，然后分別測試1 h、24 h小鼠對新舊物體的探索時間，計算偏好指數(shù)。小鼠在在物體A1探索時間，即F，在物體A2/B2探索時間為N，偏好指數(shù)=(N-F)/(N+F)×100%。

1.5.3血清和腦組織海馬區(qū)相關(guān)蛋白及炎癥因子水平 在灌胃結(jié)束的次日，將全部小鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，從眼球取血，低溫離心機4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取其上清，置于4 ℃冰箱保存；同時分離出腦組織海馬區(qū)，置于-80 ℃冰箱保存，檢測時4 ℃超聲勻漿為0.01%的組織懸液。各指標(biāo)檢測嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒步驟進行。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數(shù)比較與正常組比較，模型組小鼠第1～5天的逃避潛伏期均明顯延長(P均<0.05)，穿越原平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)。第1天，梓醇-川芎嗪方高劑量組小鼠的逃避潛伏期明顯短于模型組(P<0.05)；第2天，梓醇-川芎嗪方中、高劑量組及安理申組小鼠的逃避潛伏期均明顯短于模型組(P均<0.05)；第3～5天，梓醇-川芎嗪方各組和安理申組小鼠的逃避潛伏期均明顯短于模型組(P均<0.05)；梓醇-川芎嗪方高劑量組第3天的逃避潛伏期和梓醇-川芎嗪方中、高劑量組及安理申組第4天、第5天的逃避潛伏期均明顯短于梓醇-川芎嗪方低劑量組(P均<0.05)，梓醇-川芎嗪方高劑量組第4天、第5天的逃避潛伏期均明顯短于川芎嗪方中劑量組和安理申組(P均<0.05)。梓醇-川芎嗪方各組和安理申組小鼠穿越原平臺次數(shù)均明顯多于模型組(P均<0.05)，且梓醇-川芎嗪方高劑量組明顯多于梓醇-川芎嗪方低、中劑量組及安理申組(P均<0.05)，梓醇-川芎嗪方中劑量組及安理申組均明顯多于梓醇-川芎嗪方低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和阿爾茨海默病各組小鼠Morris水迷宮實驗逃避潛伏期和跨越平臺次數(shù)比較

2.2各組小鼠對新物體的偏好指數(shù)比較 模型組1 h、24 h對新物體的偏好指數(shù)均明顯低于正常組(P均<0.05)；梓醇-川芎嗪方各組和安理申組1h、24h對新物體的偏好指數(shù)均明顯高于模型組(P均<0.05)，且梓醇-川芎嗪方高劑量組明顯高于梓醇-川芎嗪方低、中劑量組及安理申組(P均<0.05)，梓醇-川芎嗪方中劑量組及安理申組均明顯高于梓醇-川芎嗪方低劑量組(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組和阿爾茨海默病各組小鼠對新物體的偏好指數(shù)比較(±s，%)

2.3各組小鼠血清和腦組織海馬區(qū)Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量比較 模型組小鼠血清和腦組織海馬區(qū)Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量均明顯高于正常組(P均<0.05)。梓醇-川芎嗪方各組和安理申組小鼠血清和腦組織海馬區(qū)Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且梓醇-川芎嗪方高劑量組明顯低于梓醇-川芎嗪方低、中劑量組及安理申組(P均<0.05)，梓醇-川芎嗪方中劑量組及安理申組均明顯低于梓醇-川芎嗪方低劑量組(P均<0.05)。見表3及表4。

表3 正常組和阿爾茨海默病各組小鼠血清Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量比較

表4 正常組和阿爾茨海默病各組小鼠腦組織海馬區(qū)Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量比較

2.4各組小鼠血清和腦組織海馬區(qū)炎癥相關(guān)因子水平比較 模型組小鼠血清和腦組織海馬區(qū)IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平均明顯高于正常組(P均<0.05)。梓醇-川芎嗪方各組和安理申組小鼠血清和腦組織海馬區(qū)IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且梓醇-川芎嗪方高劑量組明顯低于梓醇-川芎嗪方低、中劑量組及安理申組(P均<0.05)，梓醇-川芎嗪方中劑量組及安理申組均明顯低于梓醇-川芎嗪方低劑量組(P均<0.05)。見表5及表6。

表5 正常組和阿爾茨海默病各組小鼠血清IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平比較

表6 正常組和阿爾茨海默病各組小鼠腦組織海馬區(qū)IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平比較

3 討 論

梓醇-川芎嗪方來源于本課題組長期臨床經(jīng)驗總結(jié)出來治療AD的有效方劑—恒清Ⅱ號方[10-15]，該方由熟地黃15 g、川芎10 g組成，專利號為201910371018.5。梓醇是從地黃中提取的環(huán)烯醚萜類化合物，其在熟地黃中的平均含量為0.267%；川芎嗪為川芎中的主要生物堿，川芎中川芎嗪含量為0.152 3%。梓醇可以通過抑制神經(jīng)元凋亡、抗氧化、促血管新生、促神經(jīng)營養(yǎng)因子等途徑起到防治AD的作用[16]，川芎嗪具有抗炎、抗氧化、抗血小板作用[17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，梓醇-川芎嗪方改善AD小鼠認(rèn)知障礙的效果優(yōu)于梓醇或川芎嗪單用及安理申干預(yù)[6]。本課題組為梓醇-川芎嗪方申請了國家專利，且已經(jīng)獲得授權(quán)，專利號：ZL 202011556436.0，授權(quán)公告號：CN 112336738 B。

神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞進行性變性和死亡的重要機制，是引起AD發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，調(diào)控神經(jīng)炎癥可能成為AD治療的突破點和未來的治療手段[18-19]。AD的發(fā)病與Aβ、Tau和p-Tau的大量沉積有密切關(guān)系，而這些蛋白能引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的活化且促進炎性因子的表達，因此認(rèn)為AD的發(fā)病與炎癥密切相關(guān)[20]。故本實驗從神經(jīng)炎癥角度探討了梓醇-川芎嗪方對AD的影響。

本研究中，與模型組比較，梓醇-川芎嗪方各組APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠的逃避潛伏期更短，小鼠穿越原平臺次數(shù)增多，小鼠的1 h、24 h對新物體的偏好指數(shù)增高，血清和腦組織海馬區(qū)Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量及IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平降低，且其作用與劑量呈正相關(guān)。證實梓醇-川芎嗪方可以呈劑量依賴性改善APPswe/PS1ΔE9小鼠的學(xué)習(xí)記憶行為，且高劑量作用更明顯，機制可能與降低血清和腦組織海馬區(qū)Aβ、Tau、p-Tau蛋白及炎性因子IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平，抑制神經(jīng)炎癥有關(guān)，進一步為梓醇-川芎嗪方的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。