譚志韻，羅漢文，彭 莎，趙新新，賴亦靜

（1.佛山市中醫(yī)院骨科，廣東 佛山 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又稱退行性關(guān)節(jié)病，首先出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的變性，隨后發(fā)生鄰近軟骨增生、繼而骨化形成骨關(guān)節(jié)病變，其中以膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）的發(fā)病率最高[1-2]。KOA 是以退行性病理改變?yōu)榛A(chǔ)的疾病，多發(fā)于中老年人群，其癥狀多表現(xiàn)為膝蓋紅腫痛、上下樓梯時疼痛、坐起立行時膝部酸痛不適等。也會有患者表現(xiàn)膝蓋節(jié)腫脹、彈響、積液等，如不及時治療，則會引起關(guān)節(jié)畸形，甚至致殘[3]，其病變最主要為膝關(guān)節(jié)軟骨的損傷，以及在軟骨破損后引起的一系列廣泛病理改變，后期甚至嚴(yán)重影響行走功能。因此，如何有效治療KOA 是降低致殘率、改善老年人生活質(zhì)量的一個需要迫切解決的問題。

黃芪鱉甲丸為佛山市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑（粵藥制字Z20060051），用于醫(yī)治退行性骨關(guān)節(jié)病、骨質(zhì)疏松癥等，以中醫(yī)的“腎主骨”及“補腎”等作為理論基礎(chǔ)，在醫(yī)治腎精不足型KOA 上取得良好療效[4]。本實驗擬在前期研究的基礎(chǔ)上，探討黃芪鱉甲丸對缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）信號通路的影響，分析研究黃芪鱉甲丸治療KOA的作用機制，為中醫(yī)藥治療KOA 提供相應(yīng)實驗基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級SD 大鼠共60 只，雌性，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2018-0002，動物實驗環(huán)境：廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF 級動物實驗室，設(shè)施使用許可證號SYXK（粵）2020-0059。本研究經(jīng)佛山市中醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器塞來昔布膠囊（輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20140072，規(guī)格：0.2 g/粒）；黃芪鱉甲丸（佛山市中醫(yī)院，粵藥制字Z20060051，規(guī)格：7.5 g/包）。碘乙酸鈉（美國Sigma 公司，CAS 號：305-53-3，規(guī)格：5 g/瓶）；雌二醇（E2）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司；HIF-1α[免疫印跡（WB）1∶1 000，免疫組化（IHC）1∶200]、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1，WB1∶1000，IHC1∶200）、葡萄糖載體-1（Glut-1，1∶1000）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA，1∶1000）抗體（美國Proteintech 公司）。電子天平（德國Sartorius 公司，型號：BS224S），小型高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司，型號：5418），全波長多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司，型號：Varioskan Flash），熒光顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社，型號：BX51），核酸蛋白測定儀（美國Bio-Rad，型號：SmartSpec plus），電泳儀（美國Bio-Rad，型號：PowerPac Basic），多功能成像系統(tǒng)（上海Tanon，型號：5200 Multi）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組、造模及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按完全隨機分組法分為假手術(shù)組（10 只）、造模組（50 只）。采用雙側(cè)卵巢切除及關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉復(fù)制大鼠絕經(jīng)后的KOA 模型。假手術(shù)組大鼠保留卵巢，僅切開表皮及進行相應(yīng)縫合手術(shù)，造模組大鼠則在切除卵巢8周后進行關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉1 次，然后將造模組分為模型組、塞來昔布組（0.018 g/kg）、黃芪鱉甲丸高劑量組（8.100 g/kg）、黃芪鱉甲丸中劑量組（4.050 g/kg）及黃芪鱉甲丸低劑量組（2.025 g/kg），每組10 只大鼠。對給藥的組別每天灌胃相應(yīng)種類和劑量的藥物，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水，1 次/d，連續(xù)4 周。

1.3.2 取材及指標(biāo)檢測 在最后一次給藥1 h 后，將大鼠的雙膝關(guān)節(jié)毛發(fā)剔除，在麻醉成功后抽取大鼠腹主動脈血3 mL；將大鼠膝關(guān)節(jié)屈曲90°，在股四頭肌的最高點傾斜45°剪下缺口，露出髕韌帶并使用鑷子拉開，暴露關(guān)節(jié)腔的一部分。然后使用1 mL 注射器抽吸200 μL 生理鹽水用于沖洗關(guān)節(jié)腔，反復(fù)3 次，得到膝關(guān)節(jié)灌洗液；接著解剖大鼠雙膝關(guān)節(jié)，測量其橫徑；用刮匙及尖刀片小心剝離股骨髁部軟骨，轉(zhuǎn)移至EP 管后置于液氮中保存，脛骨平臺軟骨用甲醛固定。

1.3.3 大鼠膝關(guān)節(jié)橫徑測量 使用游標(biāo)卡尺測量大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)的橫徑，然后計算其平均值。

1.3.4 ELISA 檢測 采集大鼠腹主動脈血3 mL，以3 500 r/min 離心10 min，分離血清，使用ELISA 試劑盒檢測大鼠血清E2。關(guān)節(jié)腔灌洗則采用ELISA 試劑盒檢測大鼠膝關(guān)節(jié)灌洗液中的IL-1β、TNF-α。

1.3.5組織病理學(xué)觀察 將大鼠雙膝關(guān)節(jié)囊打開，觀察其股骨髁部軟骨的外觀改變。然后切取大鼠關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨，使用甲醛固定，經(jīng)過脫水脫鈣、石蠟包埋及縱向連續(xù)切片系列操作，進行番紅固綠染色，免疫組化法檢測HIF-1α及MMP-1（稀釋倍數(shù)1∶200）的表達和定位，顯微鏡下100 倍觀察并拍攝。根據(jù)軟骨形態(tài)變化及病理學(xué)染色結(jié)果，進行光鏡軟骨檢測評價標(biāo)準(zhǔn)（Mankin’s）評分[5]。

1.3.6 使用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組大鼠軟骨HIF-1α、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（Glut-1）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）、MMP-1 蛋白的表達 利用蛋白提取試劑盒提取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的總蛋白，檢測濃度后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再經(jīng)過轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，蛋白一抗孵育（稀釋倍數(shù)1∶1 000）及相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育，最后采用增強型化學(xué)發(fā)光液顯色，運用多功能成像系統(tǒng)拍照和分析條帶灰度值，選用β-actin 作為內(nèi)參蛋白，計算蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，先行Levene Statistic 方差齊性檢驗，方差齊時，采用SNK 檢驗進行組間均值的兩兩比較；方差不齊時，采用Dunnett T3 檢驗進行組間均值的兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠膝關(guān)節(jié)橫徑比較模型組大鼠膝關(guān)節(jié)橫徑明顯大于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。塞來昔布組、黃芪鱉甲丸高、中、低劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)橫徑均小于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 6組大鼠膝關(guān)節(jié)橫徑比較(mm，x)

2.2 6組大鼠血清E2 水平及膝關(guān)節(jié)灌洗液炎癥因子水平比較模型組大鼠的血清E2水平顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），黃芪鱉甲丸高、中劑量組大鼠的血清E2水平均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組大鼠膝關(guān)節(jié)灌洗液IL-1β、TNF-α水平顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），黃芪鱉甲丸高、中、低劑量組大鼠關(guān)節(jié)灌洗液IL-1β、TNF-α水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 6組大鼠血清E2 水平及膝關(guān)節(jié)灌洗液炎癥因子水平比較(pg/mL，x)

2.3 6組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)觀察及免疫組化分析假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨完整，表面無損傷且色澤光滑，無血管增生；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨光澤發(fā)暗，軟骨表面有較為明顯的缺損，可見血管增生；塞來昔布組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨較模型組大鼠軟骨有光澤，軟骨表面存在部分缺損，存在血管增生；黃芪鱉甲丸高劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面與模型組相比，軟骨光滑而富有光澤，缺損不明顯；黃芪鱉甲丸中劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中部稍有損傷，伴有血管增生；黃芪鱉甲丸低劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面有缺損，可見血管增生，見圖1。

圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察

大鼠膝關(guān)節(jié)經(jīng)番紅固綠染色后軟骨及軟骨下骨層次清晰，假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表層光滑，軟骨細胞數(shù)量及形態(tài)正常，潮線完整無紊亂，染色正常；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表層缺損明顯，軟骨細胞排列不規(guī)整，潮線紊亂，炎癥細胞浸潤明顯；塞來昔布組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表層有部分缺損，軟骨細胞排列不規(guī)整，潮線不完整，有炎癥細胞浸潤；黃芪鱉甲丸高、中劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表層光滑，軟骨細胞排列規(guī)整，細胞形態(tài)正常，潮線完整；黃芪鱉甲丸低劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表層部分缺損，軟骨細胞排列還算整齊，潮線欠規(guī)整，見圖2。

圖2 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)檢查（番紅固綠染色及免疫組化，100×）

結(jié)合大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察及染色檢查，根據(jù)Mankin’s 評分標(biāo)準(zhǔn)，模型組大鼠軟骨Mankin’s 評分明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。黃芪鱉甲丸各劑量組和塞來昔布組大鼠軟骨Mankin’s 評分明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)圖3 免疫組化染色結(jié)果，使用專業(yè)圖像分析軟件（IPP6）讀取黃染顆粒光密度值（IOD），模型組大鼠軟骨HIF-1α及MMP-1 黃染顆粒IOD 值高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。黃芪鱉甲丸各劑量組和塞來昔布組大鼠軟骨HIF-1α及MMP-1 黃染顆粒IOD 值明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 6組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s 評分及免疫組化IOD 值比較(±s)

表3 6組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s 評分及免疫組化IOD 值比較(±s)

注：Mankin’s：光鏡軟骨檢測評價標(biāo)準(zhǔn)；IOD：光密度值；HIF-1α：低氧誘導(dǎo)因子-1α；MMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶-1。

組別 例數(shù) 劑量(g/kg) Mankin’s 評分（分） IOD HIF-1α MMP-1假手術(shù)組 10 - 0.93±0.31 1 993.67±301.58 1 155.33±188.42模型組 10 - 5.90±0.36 10 540.67±972.76 8 093.33±928.27塞來昔布組 10 0.018 3.90±0.36 6 108.33±927.73 3 777.00±275.52黃芪鱉甲丸高劑量組 10 8.100 2.03±0.25 2 547.33±235.18 3 425.00±516.19黃芪鱉甲丸中劑量組 10 4.050 2.23±0.25 3 390.00±231.06 4 735.00±746.33黃芪鱉甲丸低劑量組 10 2.025 3.47±0.31 6 186.67±532.13 4 796.33±329.31 F 值 95.409 80.000 48.657 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.4 6組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨蛋白表達水平比較模型組大鼠軟骨中的HIF-1α、Glut-1、VEGF、MMP-1 蛋白表達量顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。黃芪鱉甲丸各劑量組和塞來昔布組大鼠軟骨中HIF-1α及Glut-1 蛋白表達量顯著低于模型組，黃芪鱉甲丸各劑量組大鼠軟骨中VEGF 蛋白表達量顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），黃芪鱉甲丸高、低劑量組和塞來昔布組大鼠軟骨中MMP-1 蛋白表達量顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、圖4。

圖3 6組大鼠軟骨HIF-1α、Glut-1、VEGF 及MMP-1 蛋白表達量比較

圖4 6組大鼠軟骨HIF-1α、MMP-1、Glut-1 及VEGF 蛋白表達條帶

3 討論

成年人骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風(fēng)險與年齡成正比，特別是在50歲以后，關(guān)節(jié)軟骨細胞會出現(xiàn)明顯的退變過程。Loeser等[6]證實軟骨細胞的增殖及合成能力與年齡成反比，同時還會分泌親炎癥介質(zhì)和基質(zhì)降解酶，此外，細胞外基質(zhì)也會隨年齡的增長而逐步出現(xiàn)退變性損傷，進而加速OA 的病理發(fā)展。內(nèi)源性雌激素減少亦可能導(dǎo)致OA 的發(fā)生[7]，關(guān)節(jié)軟骨中的雌激素受體對軟骨細胞的生長、抑制軟骨細胞炎癥因子表達及緩解關(guān)節(jié)不穩(wěn)定等起重要作用。本實驗采用摘除卵巢并進行膝關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉復(fù)制絕經(jīng)期后KOA 模型，模型組大鼠血清E2水平顯著降低，腫脹度明顯，關(guān)節(jié)軟骨受損嚴(yán)重，Mankin’s 評分顯著升高，而黃芪鱉甲丸高、中劑量組大鼠血清E2水平高于模型組，關(guān)節(jié)腫脹及軟骨損傷程度明顯減輕，Mankin’s 評分低于模型組，說明該藥滋陰補腎的功能對雌激素水平有一定調(diào)控作用，能減緩膝關(guān)節(jié)軟骨的損傷。

目前已發(fā)現(xiàn)多種基因與骨性關(guān)節(jié)炎有關(guān)，其中包括編碼細胞外基質(zhì)蛋白的基因、一些轉(zhuǎn)錄因子和生長因子，如HIF-1α、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、TNF-α及VEGF 等。IL-1β 通過刺激軟骨細胞合成基質(zhì)金屬蛋白酶，使軟骨基質(zhì)內(nèi)溶解蛋白分子的酶增多，繼而導(dǎo)致軟骨細胞遭受破壞[8]。TNF-α則可作用于軟骨細胞，阻止基質(zhì)大分子的生成，刺激軟骨降解酶的生成與分泌，增加軟骨聚蛋白多糖的分解，繼而破壞關(guān)節(jié)軟骨[9]。IL-1β與TNF-α相互協(xié)同導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的加重[10]。本實驗中模型組大鼠膝關(guān)節(jié)洗液IL-1β 與TNF-α水平高于假手術(shù)組，而在給予黃芪鱉甲丸干預(yù)后，其膝關(guān)節(jié)洗液IL-1β與TNF-α含量顯著降低，提示黃芪鱉甲丸高、中劑量可阻止關(guān)節(jié)軟骨的進一步損傷。

HIF-1 是維持細胞內(nèi)氧態(tài)平衡的一個重要因子，其通過控制血管生成來調(diào)動調(diào)節(jié)運氧能力，并通過調(diào)控糖酵解作用來增強機體的耐低氧能力，其生理活性主要由HIF-1α亞基的活性和表達決定。HIF-1α對保護軟骨的完整性具有重要作用，其活性降低是導(dǎo)致軟骨損傷的一個啟動因素[11]，因此了解軟骨細胞凋亡過程中HIF-1α的變化對延緩OA 的發(fā)生具有極其重要的意義。處于低氧環(huán)境中的OA 軟骨，軟骨細胞主要的代謝途徑是糖酵解。Glut-1 是HIF-1α的靶基因，是糖酵解過程中的重要物質(zhì)。OA 中HIF-1α和Glut-1 的陽性程度隨著軟骨的破壞程度加重而增加[12]。有研究證實，HIF-1α對軟骨細胞低氧狀態(tài)下的糖酵解水平起到促進作用[13]。Glut-1 表達的增加表明KOA 時軟骨細胞的糖酵解得到增強，這可能是HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性增強的結(jié)果所起到的調(diào)節(jié)作用。VEGF是目前公認的一種促血管生成因子，是HIF-1α的一個靶基因，HIF-1α于低氧下促進VEGF 的表達，VEGF 及其受體在OA 中的表達隨著軟骨破壞程度加重而增高[14]。正常狀態(tài)下，軟骨細胞在細胞因子和生長因子的雙重作用下，通過蛋白酶和蛋白酶抑制劑的含量調(diào)節(jié)來保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，并通過分泌軟骨相關(guān)細胞外基質(zhì)來保持軟骨結(jié)構(gòu)和功能上的完整性。KOA 時，關(guān)節(jié)軟骨細胞分泌過量的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），破壞了軟骨基質(zhì)合成和降解的平衡關(guān)系，導(dǎo)致軟骨被過度降解，引起軟骨退變[15]。在軟骨基質(zhì)合成與降解中，MMP-1 可以直接降解細胞外基質(zhì)中的膠原纖維和明膠，使細胞外基質(zhì)遭受破壞，同時還可介導(dǎo)其他 MMPs 蛋白破壞軟骨的合成，使損傷細胞難以修復(fù)[16-17]。MMP-1 通過誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α等炎癥因子介導(dǎo)細胞外基質(zhì)的過度降解，導(dǎo)致軟骨細胞受損、壞死，軟骨層變薄，因此導(dǎo)致關(guān)節(jié)緩沖不足，出現(xiàn)硬性摩擦導(dǎo)致疼痛、腫脹、活動受限等一系列臨床癥狀，其與軟骨破壞嚴(yán)重程度正相關(guān)[18]。本實驗通過免疫組化及Western blot 方法觀察KOA 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，發(fā)現(xiàn)軟骨損傷程度與HIF-1α、Glut-1、VEGF、MMP-1 的表達量密切相關(guān)，經(jīng)黃芪鱉甲丸治療4 周后，HIF-1α和VEGF 表達顯著降低，Glut-1 及MMP-1 表達亦有一定程度的下降，說明黃芪鱉甲丸可能是通過HIF-1α，調(diào)控VEGF 控制血管生成，通過Glut-1 調(diào)控糖酵解，及減緩基質(zhì)蛋白酶對軟骨降解[19-20]。但KOA 是一個復(fù)雜的病理變化過程，其中包含關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)滑膜的病變。本實驗?zāi)壳皟H針對KOA 關(guān)節(jié)軟骨進行研究，其對關(guān)節(jié)滑膜的影響及作用機制需進一步探索研究。

綜上所述，黃芪鱉甲丸可以改善KOA 大鼠模型膝骨性關(guān)節(jié)炎的腫脹度，降低Mankin’s 評分及關(guān)節(jié)腔內(nèi)TNF-α、IL-1β 的水平，降低大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中HIF-1α、Glut-1、VEGF、MMP-1 的表達量，其作用機制可能與抑制HIF-1α表達，調(diào)控Glut-1、VEGF，減緩親炎癥因子的表達相關(guān)。