劉細(xì)紅，李 麗，譚素萍，張金瑞，李輝珍，李 琪

[中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）婦科，廣東 深圳 518107]

原因不明反復(fù)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）是指女性與同一性伴侶連續(xù)兩次及以上發(fā)生自然流產(chǎn)，且與染色體、解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌、自身免疫異常和生殖道疾病等因素?zé)o關(guān)，是臨床上育齡女性常見的妊娠疾病之一[1]。目前在臨床上URSA 仍屬難治性不孕癥，給男女雙方造成極大的痛苦，已成為國內(nèi)外專家共同關(guān)注的醫(yī)學(xué)難題。近期，生殖免疫學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，正常胚胎不被母體排斥有賴于母胎界面的免疫耐受，而一旦這種格局被打破將導(dǎo)致URSA 的發(fā)生[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)抑制細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）可以解除調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）介導(dǎo)的移植排斥反應(yīng)的保護(hù)作用，表明CTLA-4 的表達(dá)可調(diào)節(jié)Treg 細(xì)胞的功能[3]。另外，微小RNA-142-3p（miR-142-3p）是一種長19～24 核苷酸的短鏈非編碼小RNA，調(diào)控樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能，并與T 細(xì)胞異常激活、維持Treg 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及免疫抑制功能有關(guān)[4]。因此，本研究通過結(jié)合臨床樣本，探究免疫功能失調(diào)與URSA 的發(fā)病機(jī)制相關(guān)性，并初步探討其發(fā)病的潛在機(jī)制，為臨床預(yù)防與治療提供理論參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016 年9 月至2017 年12 月中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）收治的45 例URSA 患者納入流產(chǎn)組，另選取同期于中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）進(jìn)行檢查的40 例健康早孕者作為對照組進(jìn)行回顧性研究。流產(chǎn)組研究對象年齡24～36 歲，平均年齡（29.15±4.29）歲；身高158.39～170.21 cm，平均身高（166.14±5.24）cm；體質(zhì)量45.83～70.51 kg，平均體質(zhì)量（64.82±5.76）kg；身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18～25 kg/m2，平均BMI（23.54±2.40）kg/m2；腰圍57.38～78.51 cm，平均腰圍（63.02±1.77）cm；臀圍84.27～108.73 cm，平均臀圍（92.43±4.24）cm；腰臀比0.55～0.73，平均腰臀比0.68±0.04。對照組研究對象年齡23～37 歲，平均年齡（28.28±4.75）歲；身高157.46～168.46 cm，平均身高（165.79±8.06）cm；體質(zhì)量45.27～70.88 kg，平均體質(zhì)量（62.9±6.61）kg；BMI 18～25 kg/m2，平均BMI（23.04±3.35）kg/m2；腰圍55.86～76.33 cm，平均腰圍（63.4±1.69）cm；臀圍82.75～105.41 cm，平均臀圍（92.74±4.37）cm；腰臀比0.57～0.76，平均腰臀比0.69±0.04。本研究經(jīng)中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。流產(chǎn)組產(chǎn)婦納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治的專家共識(shí)》[5]中原因不明反復(fù)性流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②流產(chǎn)在妊娠3 個(gè)月內(nèi)；③自然流產(chǎn)2 次以上；④患者雙方無遺傳性疾病；⑤內(nèi)分泌正常、無代謝性疾?。虎薹忾]抗體、血小板聚集等生化檢測正常；⑦無過敏史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有分泌系統(tǒng)疾病者；②有梅毒等病原微生物生殖道感染者；③臨床診斷資料缺失者；④患者出現(xiàn)明顯病情變化。對照組產(chǎn)婦納入標(biāo)準(zhǔn)：①未經(jīng)任何臨床治療的自然妊娠孕婦；②封閉抗體、血小板聚集、血常規(guī)、肝功能等生化檢測正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并臟器疾病、生殖道感染、生殖道畸形者；②臨床診斷資料缺失者；③研究對象出現(xiàn)明顯病情變化。

1.2 檢測方法

1.2.1 一般臨床指標(biāo)檢測 在流產(chǎn)組治療期間及對照組產(chǎn)檢期間，通過詢問、測量等手段，對人口學(xué)相關(guān)資料進(jìn)行記錄登記。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞 分別采集研究對象清晨空腹靜脈血于肝素抗凝管中，加入紅細(xì)胞裂解液離心、PBS 緩沖液洗滌；嚴(yán)格按照說明書操作，對照管加入FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG（FITC-IgG）和PE 標(biāo)記小鼠抗山羊IgG（PE-IgG）；實(shí)驗(yàn)管加入FITC 標(biāo)記小鼠抗人CD4（CD4-FITC）和PE 標(biāo)記小鼠抗人CD25（CD25-PE）（美國R&D 公司），室溫避光孵育后，離心（3 500 r/min 轉(zhuǎn)速，時(shí)間10 min），取上清液；加入細(xì)胞染色緩沖液，采用流式細(xì)胞儀（美國BD 公司，型號(hào)：BD Accuri C6）檢測。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測Th1/Th2 型細(xì)胞因子 抽取研究對象外周靜脈血，離心取上清液。檢測γ 干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek 公司，型號(hào)：Synergy H1）測定各孔的吸光值，進(jìn)一步推斷計(jì)算各個(gè)標(biāo)本中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10 的濃度。

1.2.4 熒光素酶檢測 培養(yǎng)293T 細(xì)胞，取質(zhì)粒2 μg，野生型（Wild type，WT）/突變型（Mutant type，Mut）psi CHECK2報(bào)告載體：miR-142-3p 擬似物（miR-142-3p minic）/miR-142-3p 抑制劑（miR-142-3p inhibitor）=1∶1，與0.5 mL 減血清培養(yǎng)基（opti-MEM）混勻；取5 μL 脂質(zhì)體200 轉(zhuǎn)染試劑與0.5 mL opti-MEM 混勻；將質(zhì)?；旌衔锱c轉(zhuǎn)染試劑混合物混勻，靜置。將上述混合物均勻滴加到標(biāo)記好的六孔板中，恒溫培養(yǎng)。將培養(yǎng)基吸除，加裂解緩沖液裂解細(xì)胞，移入96 孔板；加熒光素酶測定試劑Ⅱ檢測熒光值。BLAST 生信分析，在Targetscan 官方網(wǎng)站上（https://www.targetscan.org/vert_80/）基因名稱輸入CTLA-4，microRNA 名稱內(nèi)輸入miR-142-3p，點(diǎn)擊提交。檢索到603 個(gè)保守位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本，搜索到對應(yīng)CTLA-4 對應(yīng)的信息，找到miR-142-3p 與CTLA-4 潛在結(jié)合的信息。

1.3 觀察指標(biāo)①分析兩組研究對象外周血中CD4+CD25+Treg 細(xì)胞百分比。②分析兩組研究對象外周血中IFN-γ、IL-2、IL-4 及IL-10 細(xì)胞因子水平。③分析miR-142-3p 與CTLA-4 的相互作用。④通過BLAST 生信分析檢索結(jié)果，找到CTLA-4 轉(zhuǎn)錄本，明確miR-142-3p與CTLA-4 結(jié)合具體信息。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t法或S-N-K 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較兩組研究對象外周血中CD4+CD25+Treg 細(xì)胞百分比流產(chǎn)組研究對象外周血中CD4+CD25+Treg 細(xì)胞百分比[（4.06±1.53）%]顯著低于對照組[（7.95±1.13）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、圖2、圖3。

圖1 對照組研究對象CD4+CD25+Treg 細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測圖

圖2 流產(chǎn)組研究對象CD4+CD25+Treg 細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測圖

圖3 兩組研究對象CD4+CD25+Treg 細(xì)胞百分比比較

2.2 兩組研究對象外周血中IFN-γ、IL-2、IL-4 及IL-10 水平比較流產(chǎn)組研究對象外周血中IL-10 和IL-4 的表達(dá)水平低于對照組，而IL-2 和IFN-γ 的表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)，流產(chǎn)組研究對象的IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-4 比值分別為（0.96±0.19）和（0.89±0.21），高于對照組（0.43±0.18、0.41±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組研究對象外周血IFN-γ、IL-2、IL-4 及IL-10 水平比較（pg/mL，x）

2.3 miR-142-3 與CTLA-4 相互作用檢測通過BLAST生信分析，明確miR-142-3p 與CTLA-4 潛在的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)兩者有較好的結(jié)合能力。同時(shí)，進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告基因檢測，結(jié)果顯示miR-142-3p 與CTLA-4 有較強(qiáng)的結(jié)合能力，表明miR-142-3p 對CTLA-4 的表達(dá)具有潛在的抑制作用，見圖4。

圖4 miR-142-3p 與CTLA-4 結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合能力分析

3 討論

近年來，隨著機(jī)體免疫學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)URSA與異常的母體系統(tǒng)免疫反應(yīng)有關(guān)，其具體的發(fā)病機(jī)制尚待進(jìn)一步研究[6-7]。有研究顯示，與正常未孕婦女及URSA 患者相比，正常早孕婦女外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞水平顯著升高，表明CD4+CD25+Treg 細(xì)胞在維持正常妊娠中扮演重要角色，可能對母胎免疫耐受具有調(diào)節(jié)作用[8]。研究表明，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞在細(xì)胞免疫功能中發(fā)揮極其重要的作用[9]。在器官移植的免疫排斥反應(yīng)中，CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量減少，CD4+CD25+T 細(xì)胞被激活產(chǎn)生細(xì)胞毒性，引起免疫損傷，并協(xié)助B 細(xì)胞參與抗原-抗體聯(lián)合反應(yīng)。在T 細(xì)胞受體激活后，Tregs 可抑制CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞細(xì)胞中IL-2 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，以抑制T 細(xì)胞的增殖和激活，從而調(diào)節(jié)免疫耐受[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)組研究對象外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞顯著高于對照組，與上述研究結(jié)果類似。另外，與正常妊娠組相比，URSA 患者體內(nèi)Th1 型細(xì)胞因子呈遞增趨勢，而Th2 型細(xì)胞因子呈下降趨勢，從而導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生，故調(diào)節(jié)Th1/Th2 的平衡有助于降低URSA 的發(fā)生率[11]。本研究結(jié)果顯示，URSA 患者的外周血細(xì)胞因子IL-10 和IL-4 的表達(dá)水平均顯著低于對照組，而細(xì)胞因子IL-2 和IFN-γ 的表達(dá)水平高于對照組。

CTLA-4 已被證明是T 細(xì)胞功能的負(fù)調(diào)控因子，參與Th1/Th2 細(xì)胞的發(fā)育和Treg 細(xì)胞的功能，在維持免疫系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面的關(guān)鍵作用[12]。研究顯示，抗CTLA-4 抗體可增強(qiáng)Th1 型免疫和抑制Treg 細(xì)胞活性[13]。同時(shí)，許多微小RNA（miRNA）在多種病理病例中直接或間接調(diào)節(jié)CTLA-4和程序性死亡受體-1/程序性死亡配體-1（PD-1/PD-L1）的表達(dá)[14]。

綜上所述，miR-142-3p 與CTLA-4 具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，表明miR-142-3p 對CTLA-4P 的表達(dá)具有潛在的抑制作用，這可能是導(dǎo)致URSA 發(fā)生的可能機(jī)制之一。