帥晉豪，王鵬，季昳馳

(眉山市人民醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科,四川 眉山 621000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在全球發(fā)病率以每年3.1%的速度增長，從1980年的64.1萬例增加到2010年的160萬例[1]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布2020年女性患乳腺癌約226萬例，其中死亡人數(shù)達68萬[2]。乳腺癌的治療策略因分子亞型而異，目前已鑒定出LuminalA型、Luminal B型、HER2陽性型和三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)4種亞型。TNBC的特征是雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子 2-受體不表達，約占所有乳腺癌的15%～20%。與其他亞型的乳腺癌相比，TNBC更具侵襲性的生物學(xué)特性，轉(zhuǎn)移較早、疾病進展迅速、對現(xiàn)有療法的反應(yīng)持續(xù)時間短，生存結(jié)果較差[3-4]。血清絲氨酸蛋白酶抑制劑A3(serum serpin A3，SERPINA3)是一種分泌型絲氨酸蛋白酶抑制劑，通過蛋白水解抑制幾種重要絲氨酸蛋白酶的生物活性，例如組織蛋白酶G和糜蛋白酶[4]，也是一種可被細胞因子刺激的急性期蛋白[5]。有報道顯示，SERPINA3在實體瘤中表達增加[6]，其高表達被認為與結(jié)直腸癌[7]、肝細胞癌[8]和膠質(zhì)母細胞瘤[9]的發(fā)生有關(guān)。Zhang等[10]研究表明SERPINA3的過表達促進TNBC腫瘤的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，但目前還沒有關(guān)于SERPINA3與TNBC臨床病理參數(shù)相關(guān)性的數(shù)據(jù)，亦未見SERPINA3影響TNBC患者預(yù)后的獨立危險因素的研究。本研究通過檢測TNBC腫瘤組織和癌旁組織中SERPINA3的表達，分析其在TNBC組織中的表達水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月—2019年5月診治的86例TNBC患者，按照SERPINA3在腫瘤組織中的表達情況將患者分為低表達組(免疫組化評分≤6分，n=35)和高表達組(免疫組化評分>6分，n=51)。納入標(biāo)準(zhǔn)：初次確診，術(shù)前未接受放化療等治療，行乳腺癌改良根治術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤患者，預(yù)計生存時間小于3個月，術(shù)后未遵醫(yī)囑行規(guī)范的治療。本研究經(jīng)患者知情同意。收集患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、絕經(jīng)、空腹血糖、甘油三酯、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血肌酐等一般資料。

1.2 方法

1.2.1病理資料 收集患者腫瘤組織學(xué)分級、組織病理學(xué)分類、術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)、腫瘤直徑(≤2 cm、2～5 cm、≥5 cm)、區(qū)域淋巴結(jié)狀態(tài)和遠處臟器轉(zhuǎn)移等病理資料。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測標(biāo)本 收集患者TNBC腫瘤組織及對應(yīng)的癌旁組織，采用中性甲醛固定、石蠟包埋并制備石蠟切片(厚度約4 μm)。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢測組織中SERPINA3的表達 各組石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化及枸櫞酸鈉液抗原修復(fù)一抗SERPINA3(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶400)室溫孵育30 min。DAB試劑染色3～5 min、復(fù)染1～3min、返藍1 min、中性樹膠封2，顯微鏡下每張切片隨機選取4個高倍鏡觀察定位。細胞核呈現(xiàn)棕黃色細顆粒狀物質(zhì)沉積，即為SERPINA3的陽性表達。由兩位病理科醫(yī)生在雙盲的情況下獨立閱片，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×200)，染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：無著色、淺黃色、棕黃色和棕褐色分別為0分、1分、2分和3分。陽性細胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細胞比例0、<25%、25%～<50%和≥50%分別為0分、1分、2分和3分，SERPINA3的染色強度評分×陽性細胞比例評分≤6分為低表達組(n=35)，SERPINA3的染色強度評分×陽性細胞比例評分>6分為高表達組(n=51)。

1.2.4隨訪 術(shù)后門診定期隨訪，隨訪項目主要包括臨床體檢、乳腺彩超、乳腺X線、胸片或胸部CT、腹部超聲、骨掃描(腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移>4枚等高危因素的患者)、血常規(guī)、血生化、乳腺腫瘤標(biāo)志物、心肌標(biāo)志物及治療的依從性，評估患者手術(shù)、化療和放療的不良反應(yīng)及是否有伴隨疾病的發(fā)生。隨訪時間6～36個月，隨訪時間結(jié)束或患者死亡為隨訪終點。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件分析。計數(shù)資料以[n(%)]表示，行χ2檢驗。應(yīng)用Kaplan- Meier分析法繪制SERPINA3高表達組和SERPINA3低表達組間生存曲線圖，并采用Log- rank檢驗比較兩組間的生存率。Cox單因素和多因素回歸分析影響患者無進展生存期和總生存期的危險因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

兩組TNBC患者年齡、BMI、絕經(jīng)、空腹血糖、甘油三酯、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血肌酐比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組TNBC患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between both groups

2.2 SERPINA3在TNBC組織中的表達

SERPINA3在TNBC癌旁組織中的陽性表達率為5.8%(5/86)，在TNBC癌組織中的陽性表達率為100.0%(86/86)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖1。

癌旁組織 癌組織圖1 SERPINA3在癌旁組織和癌組織中的表達(SP，×200)Fig.1 Expression of SERPINA3 in para-cancerous tissue and cancer tissue (SP,×200)

2.3 SERPINA3表達水平與TNBC患者臨床病理參數(shù)

SERPINA3高表達組患者腫瘤病理分級為Ⅱ級和Ⅲ級患者比例均高于SERPINA3低表達組，SERPINA3高表達組術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)患者比例高于SERPINA3低表達組，SERPINA3高表達組腫瘤直徑>5 cm患者比例高于SERPINA3低表達組，SERPINA3高表達組區(qū)域淋巴結(jié)陽性患者比例高于SERPINA3低表達組，SERPINA3高表達組遠處臟器轉(zhuǎn)移患者比例高于SERPINA3低表達組。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 SERPINA3表達水平對TNBC患者臨床病理參數(shù)的影響[n(%)]Tab.2 Expression of SERPINA3 and its influence on clinic-pathological parameters in TNBC patients[n(%)]

2.4 SERPINA3表達水平與TNBC患者術(shù)后3年總生存率和無進展生存率

根據(jù)隨訪結(jié)果計算患者的3年總生存率，SERPINA3高表達組患者術(shù)后3年生存率為58.8%，SERPINA3低表達組術(shù)后3年總生存率為82.9%，log-rank檢驗顯示SERPINA3高表達組術(shù)后3年總生存率低于SERPINA3低表達組(log-rankχ2=5.706，P=0.017)。SERPINA3高表達組患者術(shù)后3年無進展生存率為43.1%，SERPINA3低表達組術(shù)后3年無進展生存率為71.4%，log-rank檢驗顯示SERPINA3高表達組患者術(shù)后3年無進展生存率低于SERPINA3低表達組(log-rankχ2=6.672，P=0.010)。見圖2。

圖2 SERPINA3表達水平對TNBC患者術(shù)后3年總生存率和無進展生存率的影響Fig.2 Effects of SERPINA3 expression on postoperative 3-year overall survival rate and progression-free survival rate in TNBC patients

2.5 影響TNBC患者總生存期的單因素和多因素COX回歸分析

經(jīng)COX單因素回歸分析顯示，腫瘤組織學(xué)分級、術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)、腫瘤大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處臟器轉(zhuǎn)移及SERPINA3高表達是影響TNBC患者無進展生存期的因素；將以上因素帶入多因素COX回歸模型中分析顯示，腫瘤組織學(xué)分級Ⅲ級、術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)、腫瘤直徑≥5 cm、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處臟器轉(zhuǎn)移及SERPINA3高表達是影響總生存期的危險因素。見表3。

表3 影響TNBC患者總生存期的單因素和多因素COX回歸分析Tab.3 Uni-variate and multi-variate COX regression analysis of factors affecting overall survival in TNBC patients

2.6 影響TNBC患者無進展生存期的單因素和多因素COX回歸分析

經(jīng)COX單因素回歸分析顯示，腫瘤組織學(xué)分級、術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)、腫瘤直徑、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處臟器轉(zhuǎn)移和SERPINA3高表達為影響無進展生存期的因素，將以上因素帶入多因素COX回歸模型中分析顯示術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處臟器轉(zhuǎn)移和SERPINA3高表達為影響無進展生存期的危險因素。見表4。

表4 影響TNBC患者無進展生存期的單因素及多因素COX回歸分析Tab.4 Uni-variate and multi-variate COX regression analysis of factors affecting progression-free survival

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其中TNBC約占乳腺癌的15%，流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示TNBC發(fā)病年齡較輕，腫瘤侵襲性強，易于局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[10]。與其他乳腺癌亞型相比，TNBC患者的生存時間較短，5年內(nèi)死亡率為40%[11]。TNBC具有高度侵襲性，約46%的患者會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移后中位生存時間僅為13.3個月，術(shù)后復(fù)發(fā)率高達25%[12]。值得注意的是，TNBC患者惡性程度高、預(yù)后差、治療靶點有限，因此尋找TNBC患者新的治療靶點具有重要的臨床價值。SERPINA3也稱為α-1-抗糜蛋白酶，是一種分子量為55～66 kDa的分泌型絲氨酸蛋白酶，可抑制幾種絲氨酸蛋白酶的活性[13]。以往研究表明，SERPINA3在胞質(zhì)分裂、增殖、凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[14-15]。此外，還有報道顯示SERPINA3參與多種免疫反應(yīng)，有望成為子宮內(nèi)膜癌的潛在免疫治療靶點[16-17]。Nimbalkar等[18]人發(fā)現(xiàn)SERPINA3有助于膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)變。此外，Luo等[19]人通過實時聚合酶鏈反應(yīng)證明，高水平的 SERPINA3 信使 RNA與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。以上研究均顯示SERPINA3參與惡性腫瘤的發(fā)展，可能子宮內(nèi)膜癌和膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后，但對TNBC患者的影響還不明確。

在本研究通過免疫組化檢測到TNBC組織中SERPINA3陽性表達率高于癌旁組織，推測SERPINA3可能參與TNBC的惡性進展。通過分析TNBC組織中SERPINA3表達與TNBC病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明SERPINA3高表達促進TNBC向高級別腫瘤組織學(xué)分型進展，促進TNBC腫瘤的增長、侵襲、遠處轉(zhuǎn)移及術(shù)后的復(fù)發(fā)。Yuan等[17]研究顯示，SERPINA3高表達與膠質(zhì)瘤惡性腫瘤相關(guān)，包括高級別的腫瘤和較短的生存時間。Zhang等[10]研究顯示，SERPINA3可以調(diào)節(jié)TNBC細胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其陽性表達增加TNBC細胞對順鉑的耐藥性，因此SERPINA3可能成為治療TNBC的有效靶點。Zhang等[10]研究進一步證實了SERPINA3與TNBC的惡性侵襲相關(guān)。生存分析結(jié)果顯示，SERPINA3高表達組TNBC患者的3年總生存率和無進展生存率均低于SERPINA3低表達組，說明SERPINA3影響TNBC患者的預(yù)后。為了更進一步了解SERPINA3是否為TNBC預(yù)后不良的危險因素，Cox單因素和多因素回歸分析顯示SERPINA3高表達為TNBC 患者3年總生存率和無進展生存率的危險因素。Cao等[20]研究顯示高表達的SERPINA3與結(jié)腸癌的主要臨床病理特征密切相關(guān)，且沉默SERPINA3的表達可顯著抑制結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲，為治療結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移提供了一種有前景的治療策略。根據(jù)Zhang等[10]和Cao等[20]研究思路設(shè)想，沉默SERPINA3亦有望成為治療TNBC患者的有效靶點。

本研究僅分析TNBC組織中SERPINA3的表達與患者臨床病理特征和預(yù)后的影響，但具體的作用機制并不明確。King等[21]研究表明，SERPINA3也是一種受細胞因子調(diào)節(jié)的炎癥蛋白，對許多細胞因子非常重要，包括白細胞介素6和白細胞介素1，細胞因子失衡會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的高激活或低激活，導(dǎo)致自身免疫性疾病或免疫抑制，有利于感染和腫瘤生長。以上可能是SERPINA3表達水平增加促進腫瘤進展的作用機制，但仍需更進一步的探索，為SERPINA3在TNBC患者中靶向治療提供充分的理論依據(jù)。