楊瓊，王婧雅，王璐，周培富，何可群，嚴(yán)敏，毛大華，陳騰祥，張金娟**

(1．貴州民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬烏當(dāng)醫(yī)院，貴州 貴陽 550018)

約有20%～30%乳腺癌患者癌細(xì)胞的人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)表達(dá)明顯增高，這些Her2陽性乳腺癌患者往往預(yù)后不良、死亡率高[1-2]，其主要原因之一是Her2陽性乳腺癌細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)移率，晚期的Her2陽性乳腺癌多伴有全身多部位的轉(zhuǎn)移[3-4]。然而，早期Her2陽性乳腺癌大多數(shù)是原位低浸潤性病灶，只有在Her2激活酪氨酸激酶(Src)蛋白后，才促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和浸潤[5-6]。Her2對Src激活是以形成整合素β4(integrin β4)-Src-Her2復(fù)合體的形式實(shí)現(xiàn)的[7-8]，integrin β4并非一開始就與Src、Her2形成復(fù)合物，它是上皮細(xì)胞半橋粒的主要結(jié)構(gòu)分子。integrin β4從半橋粒上脫離下來，是形成integrinβ4-Src-Her2復(fù)合體的前提。研究發(fā)現(xiàn)，integrin β4可被鈣激活中性蛋白酶2(calcium-activated neutral protease 2，calpain 2)有限水解[9-10]。本研究主要驗(yàn)證Calpain 2是否影響integrin β4-Her2的結(jié)合，磷酸化激活Src，從而參與雌二醇(estradiol,E2)對乳腺癌SK-Br3細(xì)胞遷移和浸潤的促進(jìn)作用。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞、試劑及儀器 SK-Br3人乳腺癌細(xì)胞(本室保存)，calpain 2、Her2和integrin β4的一抗、羊抗兔二抗和兔抗鼠二抗購于美國Cell Signaling Technology 公司，Src和p-Src(Y418)一抗、兔抗鼠二抗購于美國Santa Cruz公司,CFP標(biāo)記的兔抗鼠二抗、cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗購于美國ThermoFisher公司,PVDF膜、calpain inhibitor IV和二甲亞砜(DMSO)購于美國Merck Millipore公司，十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Bisacrylamide)過硫酸銨(APS)、四甲基二乙胺(TEMED)、Tris base購于美國Sigma Aldrich公司，胎牛血清(FBS)購于四季青公司，DMEM高糖培養(yǎng)液購于美國Hyclone公司,RIPA裂解液、蛋白定量試劑盒、結(jié)晶紫、DAPI、蛋白質(zhì)上樣緩沖液購于中國碧云天生物技術(shù)公司，普通分析純試劑購于國產(chǎn)試劑公司。

1.1.2主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱購于美國Thermo Scientific公司，高速冷凍離心機(jī)購于美國Beckman Coulter公司，垂直型蛋白電泳系統(tǒng)和電泳儀購于北京六一公司，GBOX iChemiXR化學(xué)發(fā)光及凝膠成像儀購于美國Syngene公司，F(xiàn)V1000激光共聚焦掃描顯微鏡購于日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和遷移、浸潤實(shí)驗(yàn)方法 SK-Br3細(xì)胞用含10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)液，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別取1×106和1×107個細(xì)胞鋪于直徑10 cm皿中，24 h后，細(xì)胞匯合度分別達(dá)到60%(低密度培養(yǎng))和90%(高密度培養(yǎng))，加入終濃度為100 μmol/L的E2，分別于0、2、4 及8 h 收集細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞消化和重懸，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，以每孔1×105個細(xì)胞鋪于24孔板中，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞長滿；用200 μL移液器槍頭劃痕，PBS清洗脫落細(xì)胞后，加入含10 μmol/L calpain inhibitor Ⅳ的新鮮培養(yǎng)基，對照組為相同稀釋濃度DMSO，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)；分別于0、24及48 h，在倒置顯微鏡下觀察和拍照，計(jì)算劃痕愈合度。SK-Br3細(xì)胞傳代于6孔板中，12 h后，加入calpain inhibitor Ⅳ(10 μmol/L)處理24 h(對照組加入相同濃度的DMSO)。細(xì)胞重懸混勻后，以每孔1×105個細(xì)胞鋪于含10% Matrigel的Transwell小室中，下室為含10% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)16 h，刮除Matrigel后，將底面層細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色，洗脫后，560 nm下測洗脫液吸光度(OD)值，檢測浸潤細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.2細(xì)胞免疫熒光檢測方法 以每皿1×104個細(xì)胞鋪于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，24 h后加入calpain inhibitor Ⅳ(10 μmol/L)處理24 h(對照組加入相同濃度的DMSO)，10%多聚甲醛固定，1%硼氫化鈉進(jìn)行細(xì)胞打孔，5%白蛋白液封閉，加入Her2一抗4 ℃孵育過夜，cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育2 h，再加入integrin β4一抗4 ℃孵育過夜，CFP標(biāo)記的兔抗鼠二抗室溫孵育2 h，用DAPI染核，漂洗后，與激光共聚焦顯微鏡下觀察。用405 nm激發(fā)，485 nm檢測青色熒光；用540 nm激發(fā)，570 nm檢測紅色熒光，380 nm激發(fā)，420 nm檢測藍(lán)色熒光。

1.2.3免疫共沉淀和Western Blot實(shí)驗(yàn)方法 處理好的細(xì)胞用RIPA裂解液冰上裂解，離心取上清液作為蛋白樣品。取500 μL總蛋白液，用50%Protein G/A agarose去除非特異性雜蛋白，分別加入Her2和integrin β4一抗，4 ℃孵育過夜，加50 μL Protein G/A agarose，4 ℃緩慢搖動孵育4 h，離心獲取瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，取2×buffer 40 uL重懸沉淀，取20 μL進(jìn)行western bolt檢測。蛋白樣品液上樣行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗后用二抗室溫孵育2 h，用進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，化學(xué)發(fā)光及凝膠成像儀成像觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

劃痕實(shí)驗(yàn)中劃痕愈合率及浸潤實(shí)驗(yàn)中的結(jié)晶紫染色OD值采用均數(shù)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05認(rèn)為有顯著性，統(tǒng)計(jì)工具選用SPSS19.0。

2 結(jié)果

2.1 calpain-2抑制對乳腺癌細(xì)胞SK-Br3的遷移浸潤能力的影響

通過劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，calpain 2特異性抑制劑(calpain inhibitor Ⅳ)處理的細(xì)胞，劃痕愈合的速度比空白對照和DMSO對照組的細(xì)胞慢，在24 h和48 h的愈合度均明顯低于對照組(P<0.05)。細(xì)胞浸潤實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)calpain inhibitor IV處理后的SK-BR3細(xì)胞，通過Matrigel浸潤的細(xì)胞數(shù)目也明顯低于對照組(P<0.05)，表明calpain2參與了SK-BR3細(xì)胞遷移和浸潤機(jī)制。見圖1。

2.2 Calpain 2對SK-Br3細(xì)胞Her2和integrin β4表達(dá)及相互作用的影響

通過免疫細(xì)胞化學(xué)成像，在對照組SK-Br3細(xì)胞中可見，Her2主要表達(dá)于細(xì)胞膜，胞漿內(nèi)也有部分定位；integrin β4的定位要廣泛一些，除了細(xì)胞膜、細(xì)胞漿，細(xì)胞核內(nèi)也有定位。Her2和integrin β4的共定位主要在細(xì)胞膜上，在胞漿也有少量共定位。用calpain inhibitor Ⅳ處理24 h后，Her2和integrin β4的表達(dá)減少，共定位也明顯減少。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在Her2免疫沉淀物中可檢測到integrin β4，在integrin β4免疫沉淀物中可檢測到Her2。提示，在乳腺癌SK-Br3細(xì)胞中，Her2和integrin β4有相互作用。給予calpain inhibitor Ⅳ處理細(xì)胞，可以減少Her2和integrin β4之間的免疫共沉淀。表明calpain 2可以增強(qiáng)Her2和integrin β4之間的相互作用。見圖2。

注：A為細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)圖，B為根據(jù)劃痕實(shí)驗(yàn)計(jì)算的劃痕愈合率，C為細(xì)胞浸潤實(shí)驗(yàn)的浸潤細(xì)胞結(jié)晶紫染色OD值；(1)與DMSO及Control組比較，P<0.05。圖1 calpain 抑制劑Ⅳ對SK-Br3細(xì)胞遷移和浸潤能力的影響Fig.1 Inhibition of calpain inhibitor Ⅳ on the migration and invasion of SK-Br3 cancer cell

注：A為免疫細(xì)胞化學(xué)檢測的激光共聚焦成像結(jié)果，B為免疫共沉淀的Western blot檢測結(jié)果。圖2 Calpain 2影響SK-Br3細(xì)胞Her2和integrin β4的表達(dá)和相互作用Fig.2 Effect of calpain 2 on the expression and interaction of Her2 and integrin β4 in SK-Br3 cancer cell

2.3 雌二醇對calpain 2-integrin β4-Src信號通路的影響依賴細(xì)胞密度

通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，高密度培養(yǎng)乳腺癌SK-Br3細(xì)胞中的integrin β4比低密度培養(yǎng)的水解程度高，主要增多的是分子量為200 kD的片段。在高密度培養(yǎng)條件下，E2可以促進(jìn)這些integrin β4水解片段的產(chǎn)生；在低密度培養(yǎng)條件下，這種效應(yīng)不明顯。E2的刺激也可以促進(jìn)calpain 2的表達(dá)，在高密度培養(yǎng)條件下，E2刺激2 h和4 h時，calpain 2的表達(dá)明顯上調(diào)，也伴隨著integrin β4水解程度的增加，同時使Src的Y418位點(diǎn)的磷酸化水平增高。表明E2可以通過calpain 2水解其底物integrin β4，促進(jìn)Src磷酸化激活。見圖3。

注：A為高密度培養(yǎng)的SK-Br3細(xì)胞，B為高密度和低密度培養(yǎng)SK-Br3細(xì)胞的對比結(jié)果；(1)與0 h或及Dense 2 h組比較，P<0.05。圖3 E2對calpain 2-integrin β4-Src信號通路的影響依賴細(xì)胞密度Fig.3 Effect of E2 on calpain 2-integrin β4-Src signaling dependent on cell density

3 討論

研究表明，Calpain2參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，通過對下游底物蛋白進(jìn)行有限水解是其機(jī)制之一[11-13]。下游底物蛋白的有限水解，改變了蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而暴露相應(yīng)氨基酸殘基的修飾位點(diǎn)，使底物發(fā)生翻譯后修飾(post-translational modification,PTM)。Integrin β4是calpain 2底物之一，也是半橋粒的重要結(jié)構(gòu)蛋白[14-18]。integrinβ4的有限水解，可能造成半橋粒的解體，可使乳腺癌細(xì)胞失去極性，從基質(zhì)上脫離。在本研究中，利用calpain 2的特異性抑制劑Calpain inhibitor IV處理細(xì)胞，通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Matrigel實(shí)驗(yàn)檢測，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞SK-Br3的遷移浸潤能力降低。表明calpain2可以促進(jìn)SK-Br3細(xì)胞的遷移和浸潤能力。SK-Br3細(xì)胞是Her2陽性的乳腺癌細(xì)胞，表達(dá)Her 2和integrin β4蛋白。用免于熒光細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，calpain2的特異性抑制劑可以下調(diào)Her 2和integrin β4表達(dá)的同時，也減少Her 2和integrin β4共定位，通過免疫共沉淀技術(shù)也發(fā)現(xiàn)calpain2的特異性抑制劑可以減少Her 2和integrinβ4的結(jié)合。表明Her2和integrinβ4結(jié)合形成復(fù)合體，需要calpain 2的有限水解作用。

SK-Br3細(xì)胞是雌激素受體(estrogen receptor,ER)陰性的乳腺癌細(xì)胞，但此類細(xì)胞依然對E2具有反應(yīng)性，其可能機(jī)制是通過其他的雌激素受體發(fā)揮作用[12-14]，用E2處理細(xì)胞2～4 h，高密度培養(yǎng)(細(xì)胞融合度約為90%)的SK-Br3中，Calpain-2的表達(dá)上調(diào)，integrinβ4被有限水解為200 kDa的片段增多，Src的Y418位點(diǎn)的磷酸化水平增高。然而，這種現(xiàn)象在低密度培養(yǎng)(細(xì)胞融合度為60%)的SK-Br3細(xì)胞中并不明顯。表明E2對calpain-2的表達(dá)上調(diào)和激活，導(dǎo)致integrinβ4的有限水解增加，從而使Src磷酸化激活。Src磷酸化激活后，可以通過信號通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移浸潤能力。