孫寶飛，楊丹，羅道朋，曠發(fā)光，張金芬，吳昌學(xué)

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

砷是一種常見的神經(jīng)毒物，亦可導(dǎo)致全身多臟器、多系統(tǒng)損傷，砷對神經(jīng)系統(tǒng)的潛在損害風(fēng)險已成為大眾關(guān)注的熱點問題[1]。由于神經(jīng)細胞不能再生，并且神經(jīng)組織對毒物的毒性作用較其他組織更為敏感，因此砷對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用研究顯得尤為重要[2-3]。流行病學(xué)證據(jù)表明，砷可穿過血腦屏障損傷腦組織，對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)均可造成不同程度損害，且砷致神經(jīng)發(fā)育的毒性與劑量成正相關(guān)[4]。砷通過不同途徑進入機體后作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，影響人或動物的神經(jīng)系統(tǒng)功能及子代神經(jīng)發(fā)育[5]。神經(jīng)生長因子可促進神經(jīng)細胞生長、增加突觸可塑性，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[6]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進受損傷神經(jīng)元再生及分化等，是成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元維持生存及正常生理功能所必需的物質(zhì)[7]。研究發(fā)現(xiàn)BDNF在阿茲海默癥綜合征、腦缺血損傷、帕金森氏綜合征、抑郁焦慮等疾病的保護和治療中發(fā)揮重要作用[8]。MicroRNAs (miRNAs) 是一類19 ～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通常靶向一個或多個mRNA，通過降解靶mRNA 或?qū)ζ浞g水平的抑制而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達[9]。表觀遺傳學(xué)揭示miRNAs具有可逆性，可廣泛應(yīng)用于臨床研究和疾病治療等方面[10]。崔熠等[11]研究表明，表觀遺傳學(xué)修飾中發(fā)揮重要作用的miRNAs可受多種環(huán)境毒物影響，提示miRNAs在機體對環(huán)境有害化學(xué)物的反應(yīng)中扮演重要的角色，且miRNAs還可作為環(huán)境污染物暴露后敏感的早期生物效應(yīng)標(biāo)志[12]。BDNF是microRNA-155(miR-155)和microRNA-365(miR-365)的共同靶基因。miR-155作為miRNAs的重要成員之一，主要通過與靶基因不完全性互補配對結(jié)合，進而抑制其翻譯過程，下調(diào)靶基因的表達水平[9]，通過轉(zhuǎn)染miRNAs下調(diào)BDNF表達可加劇BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制狀態(tài)[13]。本研究以大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤12(adrenal pheochromocytoma 12，PC12)細胞作為研究對象，觀察不同劑量亞砷酸鈉(NaAsO2)對PC12細胞活力的影響及細胞內(nèi)miR-155和BDNF的表達變化，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 PC12細胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫。

1.1.2主要試劑與儀器 NaAsO2(美國Merck公司)，DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清 (美國Gibco公司)，BCA試劑盒(中國索萊寶公司)，β-actin一抗、BDNF一抗(武漢三鷹)，羊抗鼠IgG二抗(美國 Immunoway 公司)，MTT(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，TRIzol (美國Invitrogen公司)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)，DMSO(美國Amresco公司)，SYBR Green(大連TaKaRa公司)，5%CO2培養(yǎng)箱，高速離心機(美國Thermo 公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及建立染砷細胞模型 PC12細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(DMEM/F-12)培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，隔天換液1次，2～3 d傳代1次(融合培養(yǎng)采用胰酶消化傳代)，取對數(shù)生長期的細胞備用；將NaAsO2用去離子水制成濃度為10 mmol/L的原液作為儲備液備用，存儲于4 ℃冰箱內(nèi)。根據(jù)課題組前期及預(yù)實驗研究結(jié)果，以細胞存活率大于50%為原則設(shè)計染毒劑量和染毒時間，共設(shè)5組，即NaAsO2劑量分別為0(對照組)、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L(NaAsO2染毒組)，染毒時間為24 h。

1.2.2細胞存活率 各組PC12細胞加MTT溶液培養(yǎng)4 h，加DMSO，搖床震蕩10 min，在490 nm處測定光密度(OD)值，并計算細胞存活率[細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%]，確定NaAsO2對PC12細胞的IC50，重復(fù)3次。

1.2.3細胞超微結(jié)構(gòu) 分別收集各組細胞懸液，0.25%胰酶消化，1 000 r /min 離心5 min，PBS洗滌2次，加4 ℃預(yù)冷的3%戊二醛固定2 h，洗滌2次；4 ℃ 預(yù)冷的1%鋨酸固定1 h，PBS 洗滌2次，乙醇脫水制樣，用透射掃描電子顯微鏡下(12 000×)觀察、并拍照。

1.2.4miR-155、BDNF mRNA相對表達量 按照1.2.1項操作后，消化并收集各組細胞、使用Trizol法提取總RNA，定量后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明在PCR儀上進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)結(jié)束后得到cDNA 并測純度。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，1 個循環(huán)，95 ℃變性10 s、60 ℃退火及延伸30 s，共40個循環(huán)，重復(fù)3次，以GAPDH基因Ct 值為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算目的基因的相對水平，ΔΔCt=[(染毒組目的基因Ct值﹣染毒組內(nèi)參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值)]。

1.2.5BDNF的表達水平 各組PC12細胞棄培養(yǎng)基，用200 μL裂解液(PMSF ∶RIPA為1 ∶100)裂解細胞30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA蛋白定量試劑盒定量；加入5×Loading Buffer緩沖液，100 ℃煮沸蛋白10 min變性蛋白樣本、冷卻得到蛋白樣本；將蛋白樣本加至8%SDS-PAGE 凝膠中，按100 V、2 h進行電泳，以200 mA、2 h條件進行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h、一抗(β-actin比例為1 ∶10 000，BDNF比例為1 ∶500)4 ℃孵育過夜、二抗室溫孵育2 h，ECL顯影(A液 ∶B液為1 ∶1)，使用多功能成像儀曝光、采圖、分析，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細胞存活率

與對照組比較，NaAsO2各染毒組(除2.5 μmol/L組外)隨染毒劑量的增加，PC12細胞的存活率逐漸下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖1 不同濃度NaAsO2對PC12細胞存活率的影響(MTT)Fig.1 Survival rate in PC12 cells exposed to different doses of NaAsO2(MTT)

2.2 超微結(jié)構(gòu)

電鏡下，對照組細胞染色質(zhì)分布均勻，胞漿中等電子密度，細胞器豐富，細胞核形態(tài)規(guī)則，核膜光滑、完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布規(guī)則，網(wǎng)腔均勻一致，線粒體發(fā)達，其表面雙層膜和內(nèi)部嵴清晰，高爾基復(fù)合體極性明顯，囊腔規(guī)則。見圖2A。NaAsO2濃度為5.0 μmol/L組中出現(xiàn)凋亡細胞，細胞表現(xiàn)為輕度皺縮、有少量細胞器凋亡形成的小泡，但尚可看到許多極性明顯的高爾基復(fù)合體以及雙層膜清晰連續(xù)、內(nèi)部嵴完整的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。見圖2B。NaAsO2濃度為20.0 μmol/L組細胞損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)出細胞核溶解、胞體嚴(yán)重腫脹和不規(guī)則，染色質(zhì)高密度聚集，核膜邊界不清、間隙增寬，有大量細胞器溶解形成的空泡。見圖2C。

注：A為對照組，B為5.0 μmol/L NaAsO2組，C 為20.0 μmol/L NaAsO2組。圖2 各組PC12細胞形態(tài)(透射電鏡，×12 000)Fig.2 Morphological characteristics of PC12 cells in each group (transmission electron microscope，×12 000)

2.3 miR-155、BDNF mRNA相對表達量

與對照組比較，NaAsO2染毒組(除2.5 μmol/L組外)PC12細胞中BDNF mRNA的相對表達量均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-155的表達均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖3 不同濃度NaAsO2對PC12細胞BDNF表達量的影響(RT-qPCR)Fig.3 Expression of BDNF in PC12 cell exposed to different doses of NaAsO2(RT-qPCR)

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖4 不同濃度NaAsO2對PC12細胞miR-155表達量的影響(RT-qPCR)Fig.4 Expression of miR-155 in PC12 cells exposed to different doses of NaAsO2(RT-qPCR)

2.4 BDNF蛋白表達水平

與對照組比較，NaAsO2染毒組(除2.5 μmol/L組外)PC12細胞中BDNF 蛋白表達量均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為BDNF蛋白表達檢測結(jié)果，B為蛋白表達定量結(jié)果；(1)與對照組比較，P<0.05。圖5 不同濃度NaAsO2對PC12細胞BDNF蛋白表達水平的影響(Western blot)Fig.5 Expression of BDNF protein in PC12 cells exposed to different doses of NaAsO2(Western blot)

3 討論

慢性砷中毒可造成人體多器官損傷，砷已被國際癌癥研究機構(gòu)確認(rèn)為人類確定的Ⅰ類致癌物，可引起多種人體腫瘤的發(fā)生[14]。本研究采用不同劑量NaAsO2(0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)處理PC12細胞24 h后，與對照組相比，僅2.5 μmol/L NaAsO2組細胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余各染毒組細胞存活率均下降，且隨著劑量的增大，細胞存活率逐漸降低，提示NaAsO2與其誘導(dǎo)的細胞凋亡具有一定劑量-反應(yīng)關(guān)系。BDNF已被報道為突觸信號傳導(dǎo)的重要中介因子，BDNF與其他可塑性相關(guān)蛋白相互作用，介導(dǎo)運動誘導(dǎo)的海馬可塑性[15]。BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，不僅能夠促進神經(jīng)干細胞的增殖、遷移和分化，促進多種神經(jīng)元的存活和生長發(fā)育，而且能促進突觸的可塑性，改變腦內(nèi)神經(jīng)元的形態(tài)，增加突觸終末的密度和促進樹突和軸突的生長[16]。本課題組前期研究證實在砷暴露的小鼠中，CA1和DG中的BDNF/磷酸化CREB(pCREB)減少[4]。本研究采用RT-qPCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)暴露于不同劑量NaAsO2的PC12細胞中BDNF mRNA的表達水平較對照組降低，且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系。這一結(jié)果，與張金雷等[17]對亞慢性砷暴露對大鼠海馬組織BDNF表達的影響研究結(jié)果相一致。采用Westen blot檢測NaAsO2染毒各組PC12細胞BDNF蛋白的表達水平均低于對照組，且與染毒NaAsO2濃度呈一定劑量-反應(yīng)關(guān)系。在表觀遺傳修飾中有重要作用的miRNAs，可因環(huán)境物質(zhì)引起異常表達[18]，且可能參與了毒物的代謝轉(zhuǎn)化和毒物誘導(dǎo)的細胞毒性、損傷修復(fù)及致癌過程[19]。Leah[20]研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥刺激下，miR-155表達明顯上調(diào)，且抑制DNA修復(fù)的蛋白表達水平，導(dǎo)致基因的突變率升高，從而誘導(dǎo)癌癥發(fā)生。此外，王曉龍等[21]發(fā)現(xiàn)相較于癌旁黏膜組織，食管鱗癌組織中miR-155表達水平明顯降低，miR-155在其中可能起著抑癌基因的作用。本研究發(fā)現(xiàn)暴露于不同劑量NaAsO2下的PC12細胞miR-155表達水平較對照組高，其中存在量-效關(guān)系，提示NaAsO2暴露后可引起PC12細胞中miR-155表達水平升高。BDNF是miR-155和miR-365的共同靶基因。本研究通過蛋白印跡在PC12細胞中證實miR-155可能直接抑制靶基因BDNF的表達，提示NaAsO2暴露后，在PC12細胞中，隨著miR-155表達上調(diào)，BDNF表達降低，miR-155與BDNF呈明顯負相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，miR-155在砷暴露的PC12細胞中特異性高表達，BDNF在砷暴露PC12細胞中特異性低表達，這與朱明亮等[22]在對多形性膠質(zhì)瘤母細胞瘤患者血清中miR-155、miR-365和BDNF的表達及意義的研究結(jié)果一致。砷暴露后miR-155上調(diào)通過降低靶基因BDNF表達，減弱BDNF/TrkB/CREB信號通路活化，可能是砷造成突觸性損傷的重要機制，確切的機理還有待進一步研究。miR-155有可能作為砷致神經(jīng)損傷的一個生物學(xué)標(biāo)志。

綜上所述，砷具有神經(jīng)毒性，染砷后神經(jīng)細胞miR-155表達激活，BDNF表達降低，且呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，這可能是砷致神經(jīng)損傷的重要機制之一。本研究僅初步探討了BDNF在砷致神經(jīng)細胞中的表達變化，還需利用干預(yù)實驗進一步驗證。