左丁，馮占輝，王筱雅，陳惠心，胡穎，張金娟，楊清，葉蘭***

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 藥理學教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽 550025；3.貴州護理職業(yè)技術學院 藥物教研室，貴州 黔南州 551300；4.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 多媒體機能學實驗室，貴州 貴陽 550025)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒期嚴重缺氧性腦損傷的結果，其死亡率和發(fā)病率在全球范圍內(nèi)都很高[1-2]。HIE是由腦組織供血和供氧困難引起的，常與癲癇、腦癱、死亡、短期或長期神經(jīng)和認知功能障礙有關[3]。目前，對臨床相關的HIE的治療是出生后立即進行亞低溫治療[4-5]，但僅靠亞低溫療法并不能提供完全的神經(jīng)保護，迫切需要輔助治療。成功建立HIE疾病模型，了解HIE的病理變化，尋找切實有效的靶點至關重要。白細胞介素-11(interleukin-11，IL-11)是一種具有血小板生成活性的造血細胞因子[6]，在機體多種組織中有表達，包括大腦、脊髓、腸道和睪丸[7]。IL-11通過與細胞表面特異性受體-配體結合鏈白介素-11受體α(interleukin-11 receptor alpha，IL-11Rα)結合，并連接到信號轉導鏈可溶性糖蛋白130(glycoprotein 130，GP130)后發(fā)揮其生物學作用[8]，它們主要通過Janus激酶/STAT3、ERK/RAS和mTOR/PI3K 這3種重要途徑進行信號傳遞[9]。研究表明IL-11作為抗炎因子在各種炎癥疾病模型中均表現(xiàn)出抗炎和黏膜保護作用，如黏膜炎、炎癥性腸病等[10]。有研究認為，IL-11使少突膠質前體細胞凋亡減少、有絲分裂增強，其對少突膠質細胞的支持作用與對白細胞的抑制作用，使IL-11成為哺乳動物包括多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的潛在保護因子，但是至今還沒有IL-11對HIE疾病作用的相關報道。本研究觀察IL-11及受體在新生大鼠HIE疾病模型中的動態(tài)變化，為尋找HIE新的協(xié)同治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 新生Sprague-Dawley(SD)大鼠30只(12～18 g，7日齡)，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，雌雄各半。所有與動物有關的試驗均獲貴州醫(yī)科大學實驗室動物倫理委員會的批準。

1.1.2主要試劑和儀器 IL-11Rα(4D12)鼠單克隆抗體(sc-13090)、IL-11(A-9)鼠單克隆抗體 (sc-13306)及GP130(E-8)鼠單克隆抗體(sc-376280)均購自美國Santa Cruz公司，蘇木精-伊紅(HE)染液套裝(G1003)購自武漢賽維爾生物科技有限公司，異氟烷麻醉劑(1902801，購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；R580S型小動物麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)及AG70厭氧缺氧箱(美國Gene-Science 公司)。

1.2 方法

1.2.1建立HIE大鼠模型 將30只實驗動物分為假手術(Sham)組和模型(HIE)組，Sham組9只、HIE組21只。各組7日齡新生大鼠稱重后用1%～2%異氟烷麻醉、固定在立體定位儀上，頸部消毒、頸部正中做約5 mm的縱向切口，找到右頸總動脈、用縫合線在近心端和遠心端兩端分別進行2次結扎、并將其從中間剪斷，縫合切口后放回母鼠身邊休息；1 h后，在37 ℃恒溫水浴下用8%O2和92%N2低氧處理2 h；缺氧結束后，將乳鼠送回母鼠身邊；Sham組麻醉及手術，但不結扎右頸總動脈和缺氧，其余步驟同模型組[12]。

1.2.2短期行為學檢測 對造模后48 h的新生大鼠實施短期行為學檢測，Sham組和HIE組各6只，包括翻正反射[13]、負趨地性試驗[14]和Longa評分[15]。

1.2.3HE染色法檢測腦組織病理學變化 短期行為學測試結束后，取Sham組和HIE組各3只大鼠處死、取腦組織、4%多聚甲固定、冠狀切割成小塊備用，切塊包含大腦皮層和海馬體；然后梯度乙醇脫水和二甲苯透明、石蠟包埋、切片。脫蠟：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精 5 min、自來水洗，切片入蘇木素染液染3～5 min、自來水洗，分化液分化、自來水洗、返藍、流水沖洗；切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min。脫水封片后顯微鏡100倍鏡檢，圖像采集分析，細胞核呈藍色，細胞質呈紅色。

1.2.4檢測腦組織IL-11、IL-11Rα、GP130蛋白的表達 采用免疫印跡(Western blot)法檢測，從Sham組取3只(造模后6 h)，HIE組取15只新生大鼠不同時間點取大腦組織 (造模后6、12、24、48、72 h組)、每個時間點3只，通過蛋白質免疫印跡法檢測IL-11、IL-11Rα、GP130的表達變化。(1)制備蛋白質樣品 取適量右側腦組織(包含大腦的海馬體和大腦皮層)稱重置于玻璃勻漿器中，加入合適體積的RIPA蛋白裂解液進行蛋白質提取，使用BCA定量盒定量并制樣；(2)制膠、上樣、電泳、轉模；(3)孵育一抗、二抗，一抗為IL-11Rα(4D12，1 ∶200)、GP130(E-8，1 ∶100)、IL-11(A-9，1 ∶100)，二抗為堿性磷酸酶山羊抗鼠IgG(H+L，1 ∶10 000)；(4)ECL發(fā)光液曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 短期行為學表現(xiàn)

HIE組新生大鼠在缺氧缺血性腦損傷后，翻正反射、負趨地性試驗時間明顯延長，Longa評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 兩組新生大鼠短期行為學表現(xiàn)Tab.1 Short-term behavioral performance of neonatal

2.2 腦組織細胞形態(tài)

與Sham組比較，缺氧缺血損傷48 h后,HIE組腦組織嚴重壞死、腦干組織結構不清楚、大腦皮層顯示組織損傷、細胞核固縮、凝集，海馬CA1區(qū)域中可見多發(fā)受損細胞，細胞核集中不規(guī)則、排列紊亂。見圖1。

注：紅色箭頭指示受損及壞死細胞。圖1 兩組大鼠的大腦皮層及海馬神經(jīng)細胞形態(tài)Fig.1 Cortical and hippocampal neural cell morphology of rats between two groups

2.3 IL-11蛋白表達

與Sham組比較，缺氧缺血誘導后，HIE組大鼠腦組織IL-11蛋白水平整體呈現(xiàn)先減后增趨勢，12 h時組降至最低、從24 h組開始上調(diào)、在72 h時顯著性升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1) 與Sham組比較，P<0.05。圖2 各組大鼠腦組織IL-11蛋白表達Fig.2 IL-11 protein expression in the rat brain tissue of each group

2.4 腦組織IL-11Rα和GP130蛋白表達

缺氧缺血損傷后，HIE各組大鼠腦組織勻漿中IL-11Rα和GP130蛋白表達趨勢均呈現(xiàn)先增加后減少，在24 h時達到峰值；與Sham組比較，HIE組在24 h時IL-11Rα和GP130蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。

注：A為IL-11Rα蛋白，B為GP130表達；與Sham組比較，(1) P<0.01，(2) P<0.05。圖3 各組大鼠腦組織IL-11Rα及GP130蛋白的表達Fig.3 Expression of IL-11Rα and GP130 protein in the rat brain tissue of each group

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦病的發(fā)病機制與炎癥相關，包括巨噬細胞的活化[16]。隨著自由基和細胞外谷氨酸水平增高，星形膠質細胞、小膠質細胞和內(nèi)皮細胞被激活，釋放炎癥細胞因子[17]。另外細胞死亡包括細胞壞死和細胞凋亡，是導致新生兒腦損傷的重要原因。文獻表明HI造成大量神經(jīng)元凋亡，在不成熟的大腦組織中半胱氨酸蛋白酶caspase-3對凋亡的調(diào)控起重要作用[18]。本實驗短期行為學結果表明，HI后新生大鼠的整體運動協(xié)調(diào)能力下降，神經(jīng)認知功能發(fā)生障礙。HE結果顯示，新生大鼠腦組織在缺氧缺血損傷后，海馬CA1區(qū)和皮層區(qū)均受到不同程度的損傷，導致細胞水腫、壞死，細胞形態(tài)不規(guī)則。病理結果證實HI早期造成大量的神經(jīng)細胞凋亡，這與缺氧缺血損傷后腦病理形態(tài)變化的研究結果一致[19]。有學者對不同缺血疾病模型中IL-11時間進程變化進行了研究，肺缺血再灌注顯示缺血損傷后前6 h IL-11的表達總體呈上升趨勢[20]；在大腦中動脈栓塞模型的研究中，呈現(xiàn)先減后增趨勢[21]。本實驗通過蛋白質印跡法檢測內(nèi)源性IL-11在HI后的時間進程表達水平，與Zhang Bei等[22]研究結果相似，本研究推測腦缺氧缺血損傷不僅可以增加炎癥因子的釋放，同時也會產(chǎn)生抗炎因子進行自身防御。有研究顯示GP130mRNA在動物的錐體細胞層和顆粒細胞層的神經(jīng)元中表達，并且在短暫性前腦缺血后GP130mRNA表達上調(diào)[23]。但未發(fā)現(xiàn)IL-11Rα在相關缺氧/缺血模型中的檢測。為了確定IL-11靶向結合的兩個受體在大腦內(nèi)的存在和表達情況，本實驗也檢測了內(nèi)源性IL-11Rα和GP130蛋白在HI后的時程表達變化，結果提示兩者都在HI后6 h開始增加且在24 h蛋白表達達到峰值，其后開始降低。由此推測此靶點在新生大鼠腦內(nèi)是存在的，并參與了HIE疾病模型的病程變化，提示IL-11可能作為治療新生兒缺氧缺血性腦病的重要研究靶點，這具有重要的臨床意義。