方子文,陳玉珍,蒙蘭青

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣西百色 533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西百色 533000)

隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)了壞死性凋亡這種特殊的細(xì)胞死亡方式,受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)和RIPK3是介導(dǎo)壞死性凋亡最為關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信號因子,當(dāng)死亡受體與配體結(jié)合時(shí),形成RIPK1/RIPK3/混合譜系激酶域樣蛋白(mixedlineage kinase domain-like protein,MLKL)復(fù)合物介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。多項(xiàng)研究表明壞死性凋亡參與腦卒中、心肌再灌注損傷、腫瘤、免疫炎癥等病理機(jī)制的發(fā)生發(fā)展,近年來備受關(guān)注。本文就RIPK1和RIPK3介導(dǎo)壞死性凋亡在腦梗死中的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述,分析RIPK1和RIPK3介導(dǎo)壞死性凋亡的分子通路機(jī)制是否有可能為腦缺血損傷提供可靠的治療靶點(diǎn)。

腦梗死是導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因,是嚴(yán)重威脅我國居民健康的重大公共衛(wèi)生問題。腦供血中斷后發(fā)生的細(xì)胞死亡主要分為兩類:壞死和凋亡[1]。壞死被定義為一種細(xì)胞溶解形式的死亡,其特征是質(zhì)膜完整性的快速喪失和促炎細(xì)胞內(nèi)容物的釋放,是一種被動(dòng)且不可調(diào)控的細(xì)胞死亡。與細(xì)胞壞死相反,細(xì)胞凋亡是一種caspase介導(dǎo)的細(xì)胞死亡形式,表現(xiàn)為細(xì)胞縮小、核固縮、碎裂,避免了質(zhì)膜破裂免疫炎癥的產(chǎn)生,是受基因自主調(diào)控的細(xì)胞死亡。與細(xì)胞壞死不同,RIPK1和RIPK3介導(dǎo)的壞死性凋亡是一種由眾多細(xì)胞因子參與且受到高度調(diào)控的細(xì)胞死亡方式,其主要核心機(jī)制為:當(dāng)caspase被抑制時(shí),RIPK1和RIPK3磷酸化激活下游的MLKL,最終形成壞死小體引發(fā)細(xì)胞死亡[2]。這需要在特定的條件下刺激產(chǎn)生,如炎癥介質(zhì)TNFα、IFNγ、內(nèi)毒素和FasL等,通過TNFR1、TNFR2、IFNR、TLR3/4和Fas/TRAILR等信號通路均可啟動(dòng)導(dǎo)致壞死性凋亡的信號級聯(lián)反應(yīng)[3],其中TNF的促炎作用最強(qiáng),且TNF是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中研究最廣的神經(jīng)炎癥因子之一,因此將以TNF/TNFR1為例來闡明壞死性凋亡信號通路。

1 TNF/TNFR1啟動(dòng)的壞死性凋亡

TNF與TNFR1細(xì)胞外部分的預(yù)配體組裝域相互作用,誘導(dǎo)TNFR1三聚體形成,與TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TRADD)、RIPK1、適配蛋白2和5(TRAF2、TRAF5)、泛素連接酶1和2(cIAP1、cIAP2)、LUBAC(由Sharpin、HOIL-1和HOIP組成的線性泛素鏈組裝復(fù)合體)結(jié)合組裝成復(fù)合體Ⅰ[4]。在復(fù)合體Ⅰ中,RIPK1受多種泛素化修飾,在調(diào)節(jié)RIPK1的活化中起著關(guān)鍵作用[5]。當(dāng)TRAF2/5和cIAP1/2催化RIPK1的K63泛素化時(shí),生長因子-β-活化激酶1(TAK1)被募集和激活,介導(dǎo)下游IκB激酶(IKKs)的活化,促進(jìn)核因子-κB(NF-κB)通路的激活,細(xì)胞存活[6]。研究發(fā)現(xiàn)cIAP1和cIAP2缺乏會(huì)導(dǎo)致小鼠體重快速下降和炎癥發(fā)生,并伴有異常的細(xì)胞死亡[7]。因此cIAP1和cIAP2的缺乏使得RIPK1的泛素化受到抑制,加速了細(xì)胞凋亡和壞死的發(fā)生。

RIPK1的泛素化、去泛素化和磷酸化是三種不同的反應(yīng)機(jī)制,其導(dǎo)致的結(jié)局也不同。CYLD是一種特異性去泛素化酶,可介導(dǎo)RIPK1的K63去泛素化,加快復(fù)合體Ⅱa形成過程。復(fù)合體Ⅱa主要包括pro-caspase-8、RIPK1、FADD和TRADD,當(dāng)caspase-8未被抑制時(shí),激活細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。cIAP、TAK1或NEMO表達(dá)被抑制時(shí),復(fù)合體Ⅰ轉(zhuǎn)化為一個(gè)死亡觸發(fā)復(fù)合體Ⅱb,該復(fù)合體由FADD、pro-caspase-8、RIPK3和RIPK1組成。caspase-8活性不足或被抑制時(shí),RIPK1通過RIPK同型相互作用基序(RHIM)與RIPK3相互作用使RIPK3磷酸化[9],激活下游MLKL、PGAM5和CaMKⅡ。大量研究表明MLKL的磷酸化是由RIPK3介導(dǎo)完成的,MLKL可在多個(gè)位點(diǎn)被RIPK3快速磷酸化,磷酸化的MLKL從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上與磷脂酰肌醇磷酸(PIP)結(jié)合,MLKL寡聚形成通透性孔道[10-11],導(dǎo)致質(zhì)膜破裂,最終發(fā)生壞死性凋亡。同時(shí),磷酸化的MLKL也可使線粒體上形成一個(gè)復(fù)合物,該復(fù)合物由PGAM5l連接RIPK1-RIPK3-MLKL及PGAM5s,激活動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1),最終導(dǎo)致線粒體裂解,引發(fā)鈣超載、大量活性氧(ROS)簇生成。磷酸化的MLKL也可介導(dǎo)CaMKⅡ參與神經(jīng)細(xì)胞ROS的過度生長以及線粒體通透性過渡孔(MPTP)的開放,細(xì)胞最終壞死引發(fā)炎癥。

2 RIPK1、RIPK3通過介導(dǎo)壞死性凋亡參與腦缺血損傷

RIPK1和RIPK3是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員,該家族成員的N端因其具有同源的激酶結(jié)構(gòu)域而表現(xiàn)出類似的生物學(xué)功能[12],但因C端結(jié)構(gòu)各有差異而表現(xiàn)出功能上的多樣性,其中以RIPK1和RIPK3的研究最為廣泛。腦卒中是腦血管疾病中最常見的一類疾病,分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中,其中以缺血性腦卒中更為常見。研究如何通過干預(yù)神經(jīng)元細(xì)胞的壞死和凋亡過程來提高患者預(yù)后、減少致殘率一直是研究者們努力的方向。

YANG等[13]采用光血栓形成模型誘導(dǎo)C57小鼠大腦皮層局灶性缺血,發(fā)現(xiàn)敲除RIPK3和MLKL可使缺血皮質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的激活從M1型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型,而M2型為缺血腦組織中的抗炎表型,此后也有研究證明了M1型巨噬細(xì)胞更容易以RIPK3激酶活性依賴的方式發(fā)生炎癥相關(guān)的細(xì)胞死亡,M1型巨噬細(xì)胞則正好相反[14]。該研究發(fā)現(xiàn)RIPK3和MLKL缺失對病變大小和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)也有影響,皮層局灶性缺血后,野生型動(dòng)物(WT)、RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠的前肢活動(dòng)立即減少到大約40%的基線水平,從第7天開始,與WT對照組相比,RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠的前肢運(yùn)動(dòng)顯著恢復(fù)。足部故障試驗(yàn)表明,缺血很快導(dǎo)致所有小鼠出現(xiàn)明顯的步態(tài)故障,在RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠中,從第7天開始,足斷層步數(shù)顯著減少,不對稱指數(shù)顯著降低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明阻斷RIPK3、MLKL可以減少腦缺血后神經(jīng)元的損傷,并有助于功能恢復(fù)。

ZHANG等[15]建立大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO/R)模型模擬腦缺血再灌注損傷,在MCAO/R后24 h,小鼠梗死區(qū)域內(nèi)檢測出不可溶性RIPK1、RIPK3和MLKL的水平升高。在MCAO/R模型的基礎(chǔ)上分別設(shè)計(jì)出兩種RIP1激酶死亡小鼠(Rip1K45A/K45A和Rip1Δ/Δ mice32)、RIP3缺乏小鼠(Rip3-/-小鼠)、MLKL缺陷小鼠(Mlkl-/-小鼠)進(jìn)行研究,與WT小鼠相比,Rip1K45A/K45A小鼠和Rip1Δ/Δ mice 32小鼠、Rip3-/-小鼠、Mlkl-/-小鼠均可減輕細(xì)胞壞死和神經(jīng)炎癥來保護(hù)MCAO/R后的腦損傷,這與壞死性凋亡通路是高度一致的,說明由RIPK1、RIPK3介導(dǎo)的壞死性凋亡參與了腦缺血再灌注后的腦損傷。在NAITO等[16]的一項(xiàng)研究中,僅靠局部腦缺血不足以上調(diào)小鼠MCAO模型中磷酸化的MLKL,上調(diào)P-MLKL需要腦缺血再灌注這一條件。因此MLKL磷酸化有可能參與介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷后的細(xì)胞損傷,臨床上發(fā)現(xiàn)有一部分急性腦梗死患者腦血管再通后出現(xiàn)不同程度的腦損傷,但腦缺血再灌注損傷目前機(jī)制尚未完全明確,因此這一發(fā)現(xiàn)是有重大意義的。

3 RIPK1在腦梗死中的研究及其干預(yù)藥物

RIPK1是在細(xì)胞凋亡、壞死或存活中均起到調(diào)控作用的一個(gè)蛋白,已經(jīng)成為治療腦卒中、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫疾病和炎癥疾病的治療靶點(diǎn)[16-18],且這一觀點(diǎn)得到了廣泛研究的支持。在腦血管疾病的研究中,Necrostatin-1(Nec-1)是應(yīng)用最多、最廣的RIPK1抑制劑,Nec-1可阻斷RIPK1磷酸化的發(fā)生。在MCAO大鼠模型和OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型中,ZHU等[19]發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中RIPK1顯著升高,延遲給予RIPK1抑制劑Nec-1可下調(diào)膠質(zhì)疤痕標(biāo)志物,改善缺血性卒中誘導(dǎo)的壞死形態(tài)和神經(jīng)功能缺損,并減少腦萎縮體積。此外,他們還發(fā)現(xiàn)敲低RIPK1可以減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡和增殖,促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生成。同時(shí),活性星形膠質(zhì)細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)及其受體VEGFR-3均升高,這些結(jié)果表明RIPK1通過損害正常星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)和增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF-D/VEGFR-3信號通路參與星形膠質(zhì)細(xì)胞病和膠質(zhì)瘢痕的形成,因此,抑制RIPK1可減少星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和膠質(zhì)疤痕的形成,促進(jìn)腦功能恢復(fù)。

Nec-1是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(Dot1L)抑制劑,研究發(fā)現(xiàn)Dot1L被敲低或抑制的卒中模型小鼠中可逆轉(zhuǎn)缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,RIPK1 K63泛素化的增加和RIPK1/caspase 8復(fù)合物生成的減少可下調(diào)RIPK1依賴性的細(xì)胞凋亡,從而降低腦損傷的程度[20]。但Nec-1因其代謝穩(wěn)定性差等缺點(diǎn),未能獲得臨床應(yīng)用,也已被證明不適合用于人類[21]。此外,有研究表明鋅指蛋白91(zinc finger protein 91,ZFP91)可以通過誘導(dǎo)RIPK1去泛素化、增加線粒體ROS的產(chǎn)生,從而促進(jìn)細(xì)胞死亡[22]。卡泊芬凈是臨床上常用的一種抗真菌藥物,有研究發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈可以通過上調(diào)Pellino3(一種泛素E3連接酶)使得RIPK1泛素化增加和壞死性凋亡相關(guān)蛋白下降,改善腦梗死后的神經(jīng)功能損害。研究還發(fā)現(xiàn)其他藥物如川芎素、氯丙嗪和異丙嗪均可通過抑制RIPK1/RIPK3/MLKL通路改善梗死后的腦損傷[23-24]。

4 RIPK3在腦梗死中的研究及其干預(yù)藥物

RIPK3是一種可通過caspase-8進(jìn)行調(diào)控的蛋白因子,當(dāng)caspase-8活性不足或被抑制時(shí),RIPK3被磷酸化激活下游效應(yīng)蛋白MLKL引發(fā)壞死性凋亡。而當(dāng)RIPK3被敲除時(shí),只能由RIPK1介導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡。因此,在腦缺血后發(fā)生的壞死性凋亡中,RIPK3作為介導(dǎo)腦缺血后炎癥反應(yīng)中最具特異性的信號分子是極為關(guān)鍵的。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)RIPK3表達(dá)下降時(shí)可通過抑制程序性細(xì)胞死亡來減少腦缺血性卒中小鼠模型中的腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損和神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷,同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了RIPK3表達(dá)下調(diào)后穩(wěn)定了線粒體膜電位,抑制了鈣內(nèi)流的增加和ROS的產(chǎn)生,從而減少了炎癥的發(fā)生[25]。

通過找出RIPK3的特異性抑制劑有可能改善腦缺血后神經(jīng)元的損傷和減少卒中后炎癥反應(yīng)的發(fā)生,但RIPK3抑制劑的臨床應(yīng)用一直滯后。最早一批抑制劑如GSK'840、GSK'843和GSK'872這些化合物可以高效結(jié)合并抑制RIPK3,但是當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)以濃度依賴性的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。此前達(dá)拉非尼(Dabrafenib)被證實(shí)是有效的高親和力RIPK3抑制劑[26],是通過競爭ATP結(jié)合位點(diǎn)抑制RIPK3的激酶活性,阻斷TNF誘導(dǎo)壞死性凋亡的發(fā)生,并且在人血管內(nèi)皮細(xì)胞中得到驗(yàn)證[27]。研究發(fā)現(xiàn)在栓塞誘導(dǎo)缺血性腦損傷1小時(shí)后的小鼠腹膜內(nèi)給予Dabrafenib 10 mg/kg,第二天C57BL6小鼠的梗死灶面積明顯減小,同時(shí)TNF-α的上調(diào)明顯減弱,這表明Dabrafenib可能會(huì)減輕缺血性腦損傷后TNF-α誘導(dǎo)的壞死性途徑[28],但該藥物在腦卒中疾病中的臨床研究鮮有相關(guān)報(bào)道。研究者采用氧糖剝奪(OGD)和MCAO模型模擬缺血性腦卒中條件,發(fā)現(xiàn)zad-fmk(一種凋亡抑制劑)、GSK'872(RIPK3抑制劑)聯(lián)合治療可減輕腦細(xì)胞死亡和缺血性腦損傷[29]。

5 小結(jié)

在腦梗死中壞死性凋亡介導(dǎo)的腦損傷機(jī)制復(fù)雜且受到多方面的嚴(yán)密調(diào)控,其中以RIPK1/RIPK3/MLKL通路為代表介導(dǎo)的細(xì)胞壞死被視為核心部分,在該通路上的任何一個(gè)蛋白信號分子以及結(jié)合位點(diǎn)的不同程度改變都可引起不同的結(jié)局。在此基礎(chǔ)上發(fā)掘的一系列RIPK1、RIPK3等信號通路分子抑制劑可以在腦血管病中起到很好的神經(jīng)保護(hù)作用,但在該通路中對治療腦梗死相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)以及抑制劑的藥物毒性研究仍較少,未來仍需不斷深入挖掘相關(guān)分子作用機(jī)制及與其他壞死通路的關(guān)系網(wǎng),以期研發(fā)能用于臨床上抑制壞死性凋亡的藥物。