王敏,王鵬宇,王光明

(1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,云南大理 671000;2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院基因檢測(cè)中心,云南大理 671000)

缺血性腦卒中是一種常見(jiàn)且嚴(yán)重的腦血管疾病,占所有腦卒中的87%,是持續(xù)性殘疾的主要原因[1]。外泌體是常見(jiàn)的膜結(jié)合納米泡,含有多種生物分子,如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸。外泌體通過(guò)胞吐作用從細(xì)胞中衍生出來(lái),被靶細(xì)胞攝入,并且可以在局部或遠(yuǎn)處細(xì)胞之間傳遞生物信號(hào)。外泌體分泌是一種組成性現(xiàn)象,參與生理和病理過(guò)程,并決定外泌體表面分子和內(nèi)容物[2]。外泌體是一種內(nèi)吞來(lái)源的納米級(jí)細(xì)胞外脂質(zhì)雙分子層囊泡,在生理和病理?xiàng)l件下由幾乎所有細(xì)胞類(lèi)型分泌[2]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPC)是一種特定類(lèi)型的干細(xì)胞,在組織再生和修復(fù)中起作用[3]。內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以遷移到損傷區(qū),在參與血管新生、恢復(fù)血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的完整性、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、減輕腦卒中病理相關(guān)的運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能損傷等方面有重要作用[1]。靜脈溶栓是急性缺血性腦卒中最有效的治療手段之一,適用于癥狀發(fā)作后4.5 h內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀的患者。隨機(jī)試驗(yàn)表明,當(dāng)癥狀發(fā)作后 4.5 h內(nèi)接受靜脈重組組織纖溶酶原激活劑(Ⅳ-rtPA)治療時(shí),更多患者恢復(fù)良好功能[4]。但治療時(shí)間窗只有4.5 h,當(dāng)Ⅳ-rtPA應(yīng)用于卒中后4.5 h以上時(shí),風(fēng)險(xiǎn)可能大于獲益,而出血轉(zhuǎn)化和氧化應(yīng)激是主要的臨床風(fēng)險(xiǎn),這將進(jìn)一步放大病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5]。因此,對(duì)缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制及治療干預(yù)等進(jìn)行深入研究顯得尤為重要。卒中的病理生理過(guò)程受多種因素影響,其中炎癥和血管生成在卒中的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[6]。作為一種替代全細(xì)胞植入的治療策略,外泌體通過(guò)體液和循環(huán)將各種蛋白質(zhì)和核酸傳遞給附近和遠(yuǎn)處的受體細(xì)胞,在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用[7]?，F(xiàn)就內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體在缺血性腦卒中的治療進(jìn)展作一闡述,然后討論內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體向缺血性腦卒中臨床治療轉(zhuǎn)化的挑戰(zhàn)。

1 外泌體的來(lái)源

在細(xì)胞通訊中作為媒介的外泌體,可以由哺乳動(dòng)物的細(xì)胞分泌,在細(xì)胞間進(jìn)行信息傳送。鄰近或遠(yuǎn)處細(xì)胞的行為可以被以旁分泌或內(nèi)分泌方式從細(xì)胞釋放的外泌體所修飾。此外,供體細(xì)胞還可以重新攝取自身分泌的外泌體[8]。在神經(jīng)系統(tǒng)中,小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞可分泌外泌體,調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。

1.1 外泌體的生物學(xué)特征外泌體是由30～100 nm內(nèi)體衍生的小膜性囊泡組成,生命系統(tǒng)中被細(xì)胞釋放到細(xì)胞外液中。外泌體存在于人體體液中,如血液和腦脊液[10],具有功能性分子修飾的磷脂雙分子層,富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸[2]。通過(guò)在源細(xì)胞和靶細(xì)胞之間重新分配其負(fù)載量,在細(xì)胞間通訊中起著至關(guān)重要的作用[10]。

1.2 外泌體的分泌和調(diào)節(jié)幾乎所有的活細(xì)胞都能在不同的病理生理環(huán)境中分泌外泌體。小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、NSCs 等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞可分泌外泌體,調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞來(lái)源的外泌體在促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)炎癥和重塑卒中后大腦等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因可分化為神經(jīng)元而在腦卒中的治療中受到廣泛關(guān)注,但MSCs直徑≥15 μm,使其難以在缺血區(qū)域靶向。但外泌體具有與其供體細(xì)胞相似的生理功能,因此,來(lái)源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞和MSCs的外泌體被認(rèn)為是一種潛在的治療策略[1]。外泌體形成的第一步是細(xì)胞膜內(nèi)陷,形成早期內(nèi)體,早期內(nèi)體的進(jìn)一步內(nèi)陷包裹細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸,形成腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles,ILVs)。運(yùn)輸所需的內(nèi)體分選復(fù)合物(endosomal-sorting complex required for transport,ESCRT)家族參與調(diào)控外泌體的分子組成和ILVs的形成,如ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ負(fù)責(zé)貨物的分揀,ESCRT-Ⅲ承擔(dān)膜的變形和分裂[11]。隨著ILVs的逐漸積累,早期內(nèi)體成熟為晚期內(nèi)體,部分多囊泡內(nèi)體(multivesicular endosomes,MVEs)與細(xì)胞融合,通過(guò)胞吐作用分泌外泌體;另一部分MVEs被溶酶體降解,在這個(gè)過(guò)程中Rab GTP酶是一個(gè)關(guān)鍵的家族[12]。Rab27a和Rab27b專(zhuān)門(mén)在質(zhì)膜上對(duì)接MVEs。Rab7調(diào)節(jié)MVEs與炎癥溶酶體的2個(gè)中介體的融合來(lái)降解ILVs[13]。Rab31通過(guò)招募TBC1D2B到Rab7并進(jìn)一步抑制MVEs與溶酶體的融合來(lái)抑制MVEs的降解[14]。

1.3 內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體的特征內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)旁分泌機(jī)制刺激內(nèi)源性內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,而不是直接分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞,從而促進(jìn)內(nèi)皮再生。作為旁分泌的關(guān)鍵成分,EPC來(lái)源的外泌體已被證實(shí)具有促進(jìn)血管新生和改善功能恢復(fù)的作用[1]。EPCs對(duì)應(yīng)于具有血管生成及其新特性的細(xì)胞群,因此它們可能在中風(fēng)后BBB的重建中表現(xiàn)出獨(dú)特的作用[15]。內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體在缺血性腦卒中臨床治療中的作用有進(jìn)一步探討的價(jià)值。

2 缺血性腦卒中發(fā)生及恢復(fù)時(shí)的病理生理變化

2.1 線粒體損傷線粒體損傷是缺血性腦卒中的主要標(biāo)志之一。腦細(xì)胞(主要是神經(jīng)元)中氧氣和葡萄糖供應(yīng)不足,會(huì)引發(fā)線粒體為主要特征的級(jí)聯(lián)事件。線粒體鈣超負(fù)荷、活性氧(reactive oxygen species,ROS)過(guò)量生產(chǎn)、線粒體通透性過(guò)渡孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)開(kāi)放和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP)的釋放將線粒體置于一系列錯(cuò)綜復(fù)雜的偶然相互作用的中心[16]。缺血性腦卒中后,線粒體功能的恢復(fù)有助于腦神經(jīng)細(xì)胞的功能恢復(fù),減少缺血區(qū)域的進(jìn)展。

2.2 血腦屏障的破壞大腦是身體的免疫特權(quán)區(qū)域,通過(guò)BBB與身體的其他部分隔離。BBB是一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu),由周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞末端足組成,與緊密連接蛋白(如claudins和occludins)牢固地結(jié)合在一起,可以微調(diào)化合物在腦脈管系統(tǒng)中的流入和外排[17-18]。通過(guò)這種結(jié)構(gòu),神經(jīng)血管單元星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠與神經(jīng)元活動(dòng)一起調(diào)節(jié)血流,以匹配代謝需求。梗死后,在炎癥細(xì)胞因子釋放的驅(qū)動(dòng)下,這種結(jié)構(gòu)的完整性受到損害,導(dǎo)致溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào),外周免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。雖然這種免疫反應(yīng)在缺血性腦卒中后的早期階段可能是有益的,但長(zhǎng)時(shí)間的BBB破壞和隨后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)對(duì)修復(fù)過(guò)程是有害的[19]。在缺血性腦卒中發(fā)生后能夠克服BBB的障礙至關(guān)重要。

2.3 炎癥反應(yīng)神經(jīng)炎癥反應(yīng)是發(fā)生在缺血性腦卒中后的腦部急性病理過(guò)程。大腦發(fā)生炎癥后會(huì)加劇受損腦組織和外周血中多種細(xì)胞因子的釋放,這些細(xì)胞因子是中風(fēng)誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)中的重要介質(zhì)。炎癥介質(zhì)可以促進(jìn)受缺血影響的區(qū)域內(nèi)許多炎癥細(xì)胞型(諸如T細(xì)胞,單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞,嗜中性粒細(xì)胞和不同炎癥細(xì)胞的各種亞型)的滲透;這個(gè)過(guò)程是造成大腦進(jìn)一步缺血損傷的原因[6]。在缺血性腦卒中的早期控制炎癥反應(yīng)可以減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷,減少卒中后炎癥的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

2.4 血管生成血管生成在內(nèi)源性再生機(jī)制中具有良好的臨床意義[20]。腦卒中后梗死周?chē)⒀苊芏仍黾优c缺血性腦卒中患者更長(zhǎng)的生存時(shí)間有關(guān),并可以改善缺血性動(dòng)物模型的預(yù)后。這表明增強(qiáng)血管生成可能是促進(jìn)缺血性腦卒中后功能恢復(fù)的策略之一。血管和神經(jīng)元細(xì)胞通過(guò)各種介質(zhì)相互交流,并作為一個(gè)整體參與腦缺血的病理生理過(guò)程。缺血性腦卒中后血管生成有利于中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血半暗帶腦血流的恢復(fù),對(duì)缺血性腦卒中患者的恢復(fù)有良好的影響。如果在短時(shí)間內(nèi)缺血半暗帶血流恢復(fù),則該區(qū)域腦組織的損傷是可逆的,神經(jīng)細(xì)胞有可能存活并恢復(fù)功能[21]。

3 內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體在缺血性腦卒中的作用機(jī)制

越來(lái)越多的證據(jù)表明,基于細(xì)胞治療的積極效果是由外泌體介導(dǎo)的,這些外泌體來(lái)自接受治療的細(xì)胞。此外,外泌體已被證明具有許多優(yōu)點(diǎn),例如,克服BBB的障礙,不阻塞血管,不誘導(dǎo)缺血后的缺血損傷[1]。

3.1 內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體在缺血性腦卒中炎癥中的作用內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以遷移到損傷區(qū),參與血管新生,恢復(fù)BBB的完整性,而且在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),減輕腦卒中病理相關(guān)的運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能損傷方面具有重要作用[22]。最近的研究發(fā)現(xiàn)EPC來(lái)源的外泌體可減少梗死面積,增加腦血流量(cerebral blood flow,CBF)和腦微血管密度(cerebral microvascular density,MVD),特別是富集miR-126的外泌體增強(qiáng)治療效果[23],并發(fā)現(xiàn)富含miR-137的外泌體可對(duì)抗SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡和線粒體功能障礙,其保護(hù)作用可能與環(huán)氧合酶2 (COX2 )/前列腺素E2(PGE2)信號(hào)通路有關(guān),抑制COX2對(duì)抗炎起到有益作用[24]。

3.2 內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體在缺血性腦卒中神經(jīng)保護(hù)和血管新生的作用缺血性腦卒中是由于腦部血管阻塞導(dǎo)致的神經(jīng)功能喪失。內(nèi)皮功能障礙和血管生成減少的組合加重了腦損傷?；诟杉?xì)胞的治療是缺血性腦卒中的一個(gè)有前景的治療途徑,通過(guò)其釋放的生長(zhǎng)因子和血管生成因子對(duì)血管及神經(jīng)元單位具有保護(hù)作用[25]。EPCs具有巨大的潛力,因它們具有血管和神經(jīng)元保護(hù)、修復(fù)和再生的能力。研究發(fā)現(xiàn),在缺血性腦卒中后2小時(shí)對(duì)發(fā)生缺血性卒中的db/db小鼠通過(guò)尾靜脈隨機(jī)注射載體(PBS),內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體(EPC-EXs)或內(nèi)皮細(xì)胞分泌的富含miR-126的外泌體(EPC-EXsmiR126)。在第2天和第14天檢測(cè)梗死體積、MVD、CBF、神經(jīng)功能、血管新生和神經(jīng)再生以及裂解的半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)、miR-126和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR2)水平。發(fā)現(xiàn)輸注EPC-EXsmiR126比輸注EPC-Exs更能有效保護(hù)腦卒中小鼠的CBF、MVD,也更能有效改善糖尿病腦卒中小鼠的神經(jīng)功能[23]。

3.3 外泌體靶向治療的意義治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)是血腦屏障,它只允許小于400道爾頓的脂溶性分子自發(fā)擴(kuò)散。這可以防止約 98% 的藥物、核酸和外泌體自發(fā)定位到大腦[26]。外泌體體積小,可有效避免單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用,可自由穿過(guò)血管壁和細(xì)胞外基質(zhì)。其表面表達(dá)CD55和CD59,避免了調(diào)理素和凝血因子的激活,因此可以在生物體液中廣泛分布且穩(wěn)定。與體外合成的脂質(zhì)體等納米遞送系統(tǒng)相比,外泌體來(lái)源于機(jī)體,理論上具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。外泌體具有很強(qiáng)的歸巢靶組織或細(xì)胞的能力和穿透生物屏障(如血腦屏障)的能力[27]。這對(duì)于治療缺血性腦卒中具有重要的意義。

4 內(nèi)皮細(xì)胞外泌體在缺血性腦卒中的應(yīng)用及展望

缺血性腦卒中仍然是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的健康問(wèn)題之一,缺血后炎癥的發(fā)生以及線粒體損傷、細(xì)胞凋亡的演變?cè)趲追昼?、幾小時(shí)甚至幾天內(nèi)持續(xù),盡快恢復(fù)損傷區(qū)域的血流、減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生以及減少BBB的破壞,對(duì)于神經(jīng)功能恢復(fù)和梗死面積的減少具有重要意義。目前現(xiàn)存的成熟的缺血性腦卒中的治療方法包括靜脈溶栓和血管內(nèi)血栓的切除,但都有其局限性。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成和炎癥效應(yīng)以及克服BBB的障礙,在腦卒中治療中發(fā)揮保護(hù)和修復(fù)作用。內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體作為新的細(xì)胞療法,目前仍有許多問(wèn)題需要探討。外泌體分泌是一種組成性現(xiàn)象,參與生理和病理過(guò)程,決定于外泌體表面分子和內(nèi)容物。在臨床治療中準(zhǔn)確、高效、選擇性地識(shí)別、分離和定量?jī)?nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體至關(guān)重要。工程化的外泌體在藥物負(fù)載和靶向改造兩個(gè)方面取得進(jìn)展,藥物的負(fù)載可通過(guò)被動(dòng)裝載,如共孵育;主動(dòng)裝載,如超聲、電轉(zhuǎn)、透析、轉(zhuǎn)染等方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。靶向改造有生物連接法(通過(guò)能與外泌體鉚釘?shù)纳镦溄拥鞍讓⑾胍?fù)載在外泌體上的藥物融合在一起,構(gòu)建一個(gè)融合質(zhì)粒,通過(guò)轉(zhuǎn)染的方式,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中)和化學(xué)連接法(外泌體膜親和物質(zhì)如膽固醇等雙親性的脂類(lèi)物質(zhì)與靶向肽連接,這樣就可以將靶向肽連接在外泌體上)。也可通過(guò)末端修飾的方法來(lái)增加內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體在缺血性腦卒中的靶向性。細(xì)胞納米穿孔方法可以制備含有治療性miR-126、miR-137的外泌體。然而,這些方法可能會(huì)使內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體的表面分子結(jié)構(gòu)、內(nèi)容物等發(fā)生變化,導(dǎo)致治療中不良反應(yīng)的發(fā)生。深入地了解外泌體的分子特征,增加外泌體的分泌,改善內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體修飾策略、阻斷外泌體在循環(huán)系統(tǒng)中被消除以及增加內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體在治療中的靶向作用意義重大。未來(lái)有望用于改善缺血性腦卒中的臨床治療。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。