解雨馨，彭慧玲，先德海，鐘建橋

銀屑病是一種慢性炎癥性疾病，與遺傳易感性、免疫、炎癥、氧化應激、外界環(huán)境等因素密切相關，影響全球人群約2%～3%[1]。在組織學上主要表現為角質形成細胞(keratinocytes，KCs)異常增殖、真皮毛細血管增生和炎性細胞浸潤。目前銀屑病的發(fā)病機制仍不完全清楚，但炎癥和氧化應激被認為是致其發(fā)病的重要促進因素[2-3]。為更好地闡明銀屑病的發(fā)病機制進而開發(fā)相應的藥物，各種體內外模型得以快速發(fā)展。雖然動物模型能在一定程度上模擬人銀屑病，但由于動物和人體的差異性與倫理學爭議，使該類模型在發(fā)病機制研究和新藥療效觀察方面仍受局限。基于此，體外模型得到了很好的發(fā)展，尤其是體外三維皮膚模型具有比單層細胞模型更符合人體皮膚結構和功能的特點[4-5]。故本研究通過聯合應用腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和γ-干擾素(interferon-gamma，IFN-γ)干預正常三維皮膚模型，建立具有類銀屑病形態(tài)學、分子生物學特征的銀屑病樣三維皮膚模型，為進一步探究銀屑病的發(fā)病機制以及后續(xù)藥物研發(fā)提供理想的實驗模型。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 構建三維皮膚模型的細胞所需要的原代KCs和成纖維細胞(fibroblasts, FBs)，均來自西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院行包皮環(huán)切術的2～10歲健康兒童的包皮。該研究獲得西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(2015016A)，同時已獲取患兒家屬的書面同意，簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑 Ⅰ型鼠尾膠原蛋白購自北京鴻躍生物科技有限公司；TNF-α和IFN-γ購自美國PROTEINTECH GROUP公司；白細胞介素17(interleukin-17,IL-17)、IL-22、IL-23及活性氧(reactive oxygen species, ROS)試劑盒購自北京安迪華泰科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及谷胱甘肽(glutathione, GSH)試劑盒購自南京建成科技有限公司；角蛋白17(keratin-17, K17)、Ki67抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞的分離與培養(yǎng) 參照課題組前期實驗方法[6-8]，將獲取的新鮮包皮組織徹底清洗、消毒，去除皮下血管、脂肪等，然后將其切成0.5 cm2的組織塊，以真皮朝下浸沒于0.25%中性蛋白酶4 ℃消化過夜。次日分離表皮和真皮，進一步將其剪碎，分別置于0.1%胰酶中37 ℃消化60 min。終止消化后以1 200 r/min速度離心6～8 min。經吸管反復吹打后收集上清，予以40 μm細胞濾器過濾上清，再度離心棄上清后余留表、真皮細胞沉淀。然后予以Dk-SFM培養(yǎng)基(限制性KCs無血清培養(yǎng)基)重懸表皮細胞即KCs沉淀和含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸真皮細胞即FBs沉淀。最后分別接種于培養(yǎng)瓶內，在37 ℃、5%CO2孵箱中進行培養(yǎng)。細胞常規(guī)傳代至2～3代時進行相關研究。因課題組前期已對上述細胞成功進行鑒定，故此處未再行鑒定[6]。

1.2.2正常和銀屑病樣三維皮膚模型的建立 按照課題組前期構建正常三維皮膚模型方法[6, 8]，將200 μL的Ⅰ型鼠尾膠原蛋白、12 μL NaOH和28 μL稀釋10倍后的FBs培養(yǎng)基混勻，隨后立即加入760 μL FBs細胞懸液，充分混勻后移入Transwell上室，室溫靜置凝固后，上下室各加1 mL FBs培養(yǎng)基，置于37 ℃，含5%CO2孵箱中培養(yǎng)。3～6 d后待真皮類似物收縮成穩(wěn)定大小，接種KCs于其表面，以Dk-SFM培養(yǎng)基浸沒培養(yǎng)5～7 d，再氣-液培養(yǎng)約10～14 d獲得正常三維皮膚模型。同時在氣-液培養(yǎng)的最后4 d，每天于上室中加入7.5 ng/mL的TNF-α和7.5 ng/mL的IFN-γ，以構建銀屑病樣三維皮膚模型，肉眼每日觀察模型的變化。干預結束后，收集兩種三維皮膚模型的組織和上清，行組織病理學觀察其形態(tài)變化，運用免疫組織化學、分子學方法檢測相關蛋白表達以鑒定該模型。

1.3實驗室相關指標檢測

1.3.1HE染色檢測三維皮膚模型的病理組織改變 把經4%多聚甲醛固定、蔗糖溶液脫水后的正常皮膚組織與銀屑病樣三維皮膚組織，進行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，觀察所構建的三維皮膚模型結構。

1.3.2免疫組織化學染色檢測三維皮膚模型K17和Ki67表達情況 正常與銀屑病樣三維皮膚模型組織的前期石蠟包埋、切片等步驟同HE染色。制備好的切片經過干燥、脫蠟、水洗后，依次予以3%過氧化氫和5%BSA封閉、一抗孵育過夜。次日二抗孵育0.5～1 h、DAB顯色、蘇木素復染，脫水、封片完成后在鏡下觀察K17和Ki67的表達情況。 KCs胞漿顯示棕黃色表示K17 陽性，胞核顯示棕黃色即Ki67陽性，而未顯色則為陰性表達。

1.3.3ELISA實驗檢測IL-17、IL-23、ROS等表達水平 采用ELISA檢測正常與銀屑病樣三維皮膚模型上清中 IL-17、IL-22、IL-23、ROS、MDA、SOD和GSH的含量。具體操作嚴格參照試劑盒說明書進行，終止反應后在酶標儀上不同波長處讀取兩個樣本各指標的OD值，最后參照標準曲線量化各指標在不同樣本中的濃度。

2 結果

2.1KCs和FBs細胞形態(tài)和特征 倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現，原代人KCs呈貼壁生長，形態(tài)為多角形或鋪路石樣，3～4 d逐漸融合(圖1a)。FBs呈貼壁生長，呈梭形外觀，逐漸形成密集分布放射狀(圖1b)。

Primary KCs; Primary FBs圖1 KC和FBs原代培養(yǎng)形態(tài) (×400)Fig.1 Morphology of KCs and FBs in primary culture (×400)

2.2銀屑病樣三維皮膚模型外觀表現 正常三維皮膚模型外觀呈均勻乳白色，半透明狀，邊緣整齊無卷曲，具有一定的韌性和彈性(圖2a)。銀屑病樣三維皮膚模型則呈乳白色不透明狀，邊緣卷曲，較正常三維皮膚模型增厚、縮小(圖2b)。

Normal three-dimensional skin model; Psoriasis-like three-dimensional skin model圖2 兩種三維皮膚模型的外觀形態(tài)Fig.2 Appearance of two three-dimensional skin models

2.3銀屑病樣三維皮膚模型組織病理學表現 HE染色后光鏡下觀察，正常三維皮膚模型可見分層的表皮和真皮，表皮層由 1～3 層排列整齊、緊密的 KCs 組成，真皮層見梭形FBs 和紅色膠原(圖3a)。銀屑病樣三維皮膚模型的表皮層較正常三維皮膚模型明顯增厚，由6～8層KCs組成，真皮層仍可見FBs和紅色膠原(圖3b)。

Normal three-dimensional skin model; Psoriasis-like three-dimensional skin model圖3 兩種三維皮膚模型組織病理學改變 (×400)Fig.3 Histopathology of two three-dimensional skin models (×400)

2.4銀屑病樣三維皮膚模型高表達K17 和Ki67 免疫組化染色顯示，正常三維皮膚模型表皮細胞胞質中幾乎不表達K17(圖4a)，僅見少量胞核表達Ki67(圖4b)。銀屑病樣三維皮膚模型表皮細胞胞質中K17呈強陽性表達(圖4c)，約70%胞核表達Ki67(圖4d)。

Expression of K17 in normal three-dimensional skin model; Expression of Ki67 in normal three-dimensional skin model; Expression of K17 in psoriasis-like three-dimensional skin model; Expression of Ki67 in psoriasis-like three-dimensional skin model圖4 兩種三維皮膚模型K17和Ki67的表達情況 (×400)Fig.4 Expression of K17 and Ki67 in two three-dimensional skin models (×400)

2.5銀屑病樣三維皮膚模型炎癥因子表達上調 與正常三維皮膚模型相比，銀屑病樣三維皮膚模型上清中炎癥因子IL-17、IL-22和IL-23的表達水平顯著升高(P<0.01)(圖5)。

IL-17;IL-22;IL-23Note: A indicated normal three-dimensional skin model; B indicated psoriasis-like three-dimensional skin model;compared with the normal three-dimensional skin model, **P<0.01.圖5 兩種三維皮膚模型炎癥因子的表達Fig.5 Expression of inflammatory factors in two three-dimensional skin models

2.6銀屑病樣三維皮膚模型氧化-抗氧化平衡失調 與正常三維皮膚模型比較，銀屑病樣三維皮膚模型上清中氧化物ROS和MDA水平升高明顯(P<0.01)，而抗氧化物/酶SOD和GSH表達明顯下降(P<0.01)(表1)。

表1 兩種三維皮膚模型上清氧化應激相關指標水平Tab.1 Levels of oxidative stress-related indicators in supernatant of two three-dimensional skin

3 討論

銀屑病是一種免疫介導的慢性炎癥性疾病，可出現在任何年齡段，近年發(fā)病率呈升高趨勢，全球約2%～3%的人群日常生活與身心健康受到其影響[1]。目前銀屑病的發(fā)病機制尚未完全闡明，炎癥和氧化應激可能是促進該病發(fā)生發(fā)展的重要因素，其中一些關鍵的促炎因子參與了銀屑病的發(fā)病過程。由于缺乏一個精準、穩(wěn)定、可復制又無倫理學爭議的銀屑病臨床前模型，因而對于其發(fā)病機制的探究始終難以深入，并且極大地阻礙了新藥研發(fā)。故在本研究中，筆者通過機械分離結合酶消化法，獲得KCs和FBs，并以Ⅰ型鼠尾膠原蛋白作為支架，構建出正常三維皮膚模型。隨后予以TNF-α和IFN-γ干預建立銀屑病樣三維皮膚模型。造模完成后取皮膚模型組織經HE染色后觀察其病理學改變，免疫組織化學染色測定K17和Ki67的表達，ELISA和比色法分析兩種三維皮膚模型上清液中IL-17、IL-22、IL-23、ROS、MDA、SOD和GSH的水平變化，以探尋出更符合銀屑病特征的模型。

既往對銀屑病模型的研究主要局限于動物試驗或者細胞水平如單層細胞培養(yǎng)的KCs[9]?，F今已經成功構建出的多種銀屑病模型，如體內動物模型包括直接誘導銀屑病樣小鼠模型、異種移植小鼠模型、細胞因子注射小鼠模型、Camk4小鼠以及基因工程小鼠模型等[10-13]；但因其成本高以及動物倫理、人與小鼠免疫系統間差異等問題，使其應用受限。而體外細胞模型如以HaCaT及人KCs為細胞源，加入相關因子建立的銀屑病樣細胞模型，雖然構建方法簡單、可重復性高，但該類模型難以模擬體內狀態(tài)，尤其是難以呈現銀屑病組織病理學特點[9]。因此在更接近人體皮膚狀態(tài)下，應用三維皮膚模型進行銀屑病的研究尤為恰當。它不僅能真實地模仿人體內環(huán)境，還可避免倫理學爭議。本研究通過建立體外三維皮膚模型后加入細胞因子以模擬銀屑病狀態(tài)，最終構建出銀屑病樣三維皮膚模型。

本實驗基于課題組前期方法成功分離和培養(yǎng)出KCs和FBs，以Ⅰ型鼠尾膠原為支架混合FBs構建真皮層，再接種KCs重建表皮層，最終獲得類似人皮膚的乳白色、半透明狀物，其邊緣整齊無卷曲，具有一定韌性和彈性；同時組織病理學表現為表皮層由1～3層KCs組成，細胞排列整齊、緊密，真皮層為梭形FBs和膠原構成。這與本課題組前期[8]以及Morin[5]、Mok等[4]構建的三維皮膚模型無論是形態(tài)學還是組織病理學特征均一致，證實本研究再次成功培養(yǎng)出人正常三維皮膚模型。盡管所構建的三維皮膚表皮細胞層數略少，細胞之間的連接不夠緊密，考慮可能與體外KCs分化不良以及KCs快速增殖使角質透明蛋白和脂質的減少有關；但本實驗構建的三維皮膚已具備較完整的表、真皮結構，接近正常皮膚，這為后續(xù)銀屑病樣三維皮膚模型的建立奠定良好基礎。

眾多研究已證實TNF-α和IFN-γ是銀屑病發(fā)病的關鍵因子[9]，并與疾病的嚴重度密切相關[14]。TNF-α可通過增強血管內皮生長因子的表達以促進血管生成，還可激活NF-κB進而促進KCs增殖。而IFN-γ可以誘導抗凋亡蛋白表達，刺激KCs增殖[15]，從而加重銀屑病皮損[16]。既往的研究[9]常應用這兩種因子干預人KCs(如HaCaT細胞)以獲得銀屑病樣細胞模型[17]。因此，在課題組前期三維皮膚模型構建的基礎上優(yōu)化實驗條件，分別將7.5 ng/mL的TNF-α和7.5 ng/mL的IFN-γ加入正常三維皮膚模型中進行誘導刺激以構建銀屑病樣三維皮膚模型。實驗結果發(fā)現，加入上述因子的三維皮膚較正常三維皮膚增厚、縮小，且皮膚邊緣出現卷曲，這可能是與TNF-α和IFN-γ共同刺激后，致KCs快速增殖從而牽拉組織以及表皮生長周期明顯縮短有關。同時HE染色顯示其表皮層明顯增厚約6～8層，與人銀屑病組織病理學改變相類似，提示本課題構建的三維皮膚模型具有銀屑病的特點。

那么本研究構建的模型是否為銀屑病樣三維皮膚模型？是否具有銀屑病KCs異常增殖、炎癥及氧化應激等狀態(tài)特征？較多研究認為，炎癥和氧化應激是銀屑病發(fā)病的重要促進因素，它們始終貫穿于銀屑病的發(fā)生發(fā)展中[2-3]。銀屑病患者血清和皮損中的炎癥及氧化應激相關指標表達顯著異常，如促炎因子(IL-17、IL-23、IL-22等)以及ROS、MDA等水平升高，而SOD、GSH等降低，使銀屑病氧化應激狀態(tài)持續(xù)；在氧化應激狀態(tài)下，ROS激活MAPK、JAK/STAT等通路，促進KCs和T細胞活化并分泌一系列促炎因子，以及銀屑病特異性標志物K17和促增殖因子Ki67等形成炎癥級聯反應[10]，使KCs異常增殖、過多血管形成、炎癥持續(xù)，最終導致銀屑病發(fā)生[16-19]。因此結合上述銀屑病的發(fā)病機制，為進一步證實本研究構建的模型是銀屑病樣三維皮膚模型，本課題組又檢測了相關指標。結果發(fā)現，經TNF-α和IFN-γ誘導后的三維皮膚強表達銀屑病特異性標記K17和促增殖因子Ki67，而正常三維皮膚無明顯表達或表達很弱，提示本實驗建立的三維皮膚模型具有銀屑病生物學特性，且KCs出現異常增殖。同時IL-17、IL-22、IL-23等炎癥因子以及ROS和MDA水平顯著升高，而SOD、GSH水平降低，均提示炎癥和氧化應激發(fā)生，符合銀屑病的改變[18]，與文獻報道一致[10]。以上結果證實本研究已成功構建出銀屑病樣三維皮膚模型。

綜上所述，本研究中經TNF-α和 IFN-γ干預后的三維皮膚模型，無論是外觀、組織病理學表現，還是炎癥因子和氧化應激相關指標的變化，均符合銀屑病改變，表明通過本組實驗方法能成功構建出銀屑病樣三維皮膚模型，為銀屑病發(fā)病機制的深入研究和新藥的開發(fā)提供理想的實驗載體，值得進一步研究和應用。由于該模型不具備T細胞、神經細胞、血管等結構，仍不能完全模擬人體皮膚結構，因此需要繼續(xù)完善。