牟慧玲，曾雯，董仙，汪宇，張偉，馮江龍，蘭應(yīng)華，羅歡歡，葉藤，陸洪光

膠原蛋白(collagen)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要框架結(jié)構(gòu)[1]。人類皮膚膠原蛋白主要由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白構(gòu)成，成纖維細(xì)胞是合成膠原蛋白的主要細(xì)胞。Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ, COL-1)是最常見的膠原蛋白，占正常人皮膚膠原蛋白的70%以上[2-3]。膠原蛋白在皮膚正常生理過程及疾病的發(fā)生中有著重要的作用，如傷口愈合、皮膚老化及增生性瘢痕形成等[4-5]。近年來，促進(jìn)成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成達(dá)到醫(yī)療美容目的及抑制膠原蛋白合成治療瘢痕疙瘩成為研究熱點[6]。視蛋白(opsins, OPNs)屬于光敏 G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-couped receptors, GPCRs)超家族，通過 GPCR 信號通路介導(dǎo)光轉(zhuǎn)導(dǎo)[7-9]。視蛋白3(opsin3, OPN3)是視蛋白家族中的一員，最近的研究[10]表明，視蛋白存在于包括皮膚在內(nèi)的眼外組織中。它們不僅在眼內(nèi)有光傳導(dǎo)功能，其在眼外也有非光依賴功能。視蛋白3被發(fā)現(xiàn)可參與肝癌細(xì)胞的凋亡，在肺腺癌中促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移，在皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞中可以調(diào)節(jié)血管生成[11]；視蛋白3在皮膚中被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控黑素細(xì)胞的凋亡和色素形成[12-13]，可調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的分化[14]。視蛋白3在皮膚的多種功能被逐步揭示，本課題組進(jìn)一步關(guān)注視蛋白3是否能調(diào)控人真皮成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白，本文擬對視蛋白3在人真皮成纖維細(xì)胞中對Ⅰ型膠原蛋白合成的影響及其可能的機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑來源 正常人真皮成纖維細(xì)胞來自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院小兒外科包皮切除手術(shù)患兒的廢棄包皮，實驗獲得患者同意并經(jīng)過倫理審查；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；RT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；一抗、 二抗購自中國 Affinity公司、美國Santa Cruz公司及英國Abcam公司;Lipo-fectamine 2000購自美國Thermo Fisher公司；CCK-8 試劑盒購自日本Dojindo公司；EDU細(xì)胞增殖檢驗試劑盒購自南京碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；細(xì)胞周期與凋亡試劑盒購自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；AKT抑制劑(MK-2206 2HCI)購自美國Selleck Chemicals公司。引物由上海捷瑞生物公司合成，本研究中使用了以下人類引物：GAPDH F，5′-GACATCCGCAAAGACCTG-3′；GAPDH R，5′-GGAAGGTGGACAGCGAG-3′；OPN3 F，5′-CAATCCAGTGATTTATGTCTTCATGATCAGAAAG-3′；OPN3 R，5′-GCATT-TCACTTCCAGCTGCTGGTAGGT-3′；COL1A1 F，5′-TGAGCCAGCAGATCGAGA-3′；COL1A1 R，5′-ACCA-GTCTCCATGTTGCAGA-3′。

1.2細(xì)胞分離及培養(yǎng) 正常人真皮成纖維細(xì)胞(NHDFs)是利用4～12歲小兒包皮手術(shù)后廢棄包皮，消毒、清洗、去除皮下組織后剪成約1 cm×1 cm皮片，使用0.25% Dispase酶將組織塊4 ℃過夜消化，眼科鑷分離真表皮，將真皮貼于培養(yǎng)皿中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱倒置2 h后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，3～7 d后成纖維細(xì)胞從組織塊中爬出。待大量成纖維細(xì)胞爬出后，移去組織塊，0.25%胰酶消化、傳代，并于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至第3～5代使用。

1.3細(xì)胞免疫熒光 將細(xì)胞以1×104個細(xì)胞的密度接種到蓋玻片上，培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌3次。細(xì)胞在室溫下用95%乙醇固定10 min，然后在室溫下干燥。胎牛血清37 ℃封閉 30 min，4 ℃孵育一抗過夜。次日，PBS洗滌3次后，加入熒光標(biāo)記的二抗，常溫孵育1 h，最后使用DAPI核復(fù)染劑染色10 min，在統(tǒng)一曝光條件下，用熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.4實時熒光定量PCR分析 將細(xì)胞收集好，使用總RNA抽取試劑提取總RNA，RNA濃度由分光光度計測得，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后使用熒光定量試劑盒檢測所選靶基因的表達(dá)水平，計算目的基因的2-ΔC或2-ΔΔCt值分析其表達(dá)水平。

1.5蛋白免疫印跡分析 收集細(xì)胞并使用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，然后使用酶標(biāo)儀檢測總蛋白濃度，將蛋白熱變性，加入40 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉2 h，然后在一抗工作液(β-Tublin，OPN3，COL1A1，PI3K，p-PI3K，AKT，p-AKT)中于4 ℃孵育過夜，洗滌后再與相應(yīng)的二抗工作液室溫下孵育1 h。最后，利用化學(xué)發(fā)光顯影劑ECL曝光顯示特定條帶。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將第3～5代細(xì)胞以4×104個/孔的細(xì)胞密度接種在6孔板中，設(shè)計針對人視蛋白3的小干擾RNA，將細(xì)胞分為對照組RNAi-control組和靶向沉默視蛋白3的RNAi-OPN3組(序列號分別為siRNA-control 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；siRNA-OPN3 5′-GUCACCUUUACCUUCGUGUTT-3′)，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑用以協(xié)助小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA) 轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，根據(jù)制造商的方案，最終濃度為50 nmol/L，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，使用蛋白質(zhì)免疫印跡和實時熒光定量PCR檢驗轉(zhuǎn)染效率。

1.7細(xì)胞活力檢驗 使用CCK-8試劑盒檢驗細(xì)胞增殖活力。細(xì)胞沉默視蛋白3后1×104/孔接種在96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，在0、24、48、72 h，加入10 μL CCK-8溶液并在37 ℃下再孵育2 h，然后使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度。

1.8EDU檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞沉默視蛋白3后以2×104/孔接種在24孔板中，每孔加入10 mmol/L的EDU在37 ℃下孵育2 h，然后使用4%多聚甲醛室溫下固定15 min，在含0.3%的Triton X的通透液中孵育15 min后，與Click反應(yīng)液一起室溫下避光孵育30 min，再與Hocheset33342一起室溫下避光10 min。最后，在熒光顯微鏡下選取5個視野，統(tǒng)計增殖細(xì)胞占總細(xì)胞的比值進(jìn)行分析。

1.9Transwell實驗 在24孔板中加入400 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，然后放入小室，在小室中以1×104個/孔的細(xì)胞密度在200 μL血清的DMEM培養(yǎng)基中種入細(xì)胞。在觀察時間點(24、48 h)將小室取出，先用4%多聚甲醛在室溫下固定細(xì)胞20 min，然后用結(jié)晶紫染色液染色10 min后在PBS緩沖液中漂洗小室，將小室風(fēng)干，通過倒置顯微鏡觀察并拍照。對穿過小室的細(xì)胞數(shù)使用Image J軟件進(jìn)行計數(shù)。

1.10酶聯(lián)免疫吸附測定法 細(xì)胞沉默視蛋白3后以4×104個/孔接種在6孔板中，分別在24、48 h收集培養(yǎng)液，離心后取上清液，按照R&D system公司ELISA試劑盒(貨號DY6220-05)標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行實驗，最后在450 nm下檢測吸光度值，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到分泌蛋白量。

1.11細(xì)胞周期檢測 細(xì)胞干預(yù)后用PBS洗滌細(xì)胞，然后用70%乙醇4 ℃固定過夜，最后用RNase及碘化丙啶37 ℃避光孵育30 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測，最后用Flow Jo10軟件分析細(xì)胞周期分布。

2 結(jié)果

2.1OPN3及COL-1在正常人真皮成纖維細(xì)胞中表達(dá) 在人真皮成纖維細(xì)胞(NHDFs)中OPN1～5均有表達(dá)，且OPN3表達(dá)明顯高于其他OPNs(t=20.53、14.59、22.82、19.84，P<0.05)，提示OPN3可能在NHDFs中發(fā)揮重要作用，見圖1。免疫熒光結(jié)果顯示，OPN3和COL-1在NHDFs中呈陽性染色，OPN3主要分布于細(xì)胞膜上，見圖2。

Note: OPN3 compared with OPN1，OPN2，OPN4 or OPN5，*P<0.05.The relative mRNA expression level of OPNs were detected by RT-PCR;The relative protein expression level of OPNs were detected by Western blot圖1 OPNs在正常人真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of OPNs in normal human dermal fibroblasts

Note:The left panel represented the localization of OPN3(green) at the plasma membrane, and the localization of COL-1(red) at the whole cell, the middle panel represented the nucleus stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)(blue) and the right panel represents an overlay of the middle panel and the phase contrast image.～Representative images showed OPN3 and COL-1 protein expression in NHDFs圖2 OPN3及COL-1在正常人真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)和定位 (×400)Fig.2 The expression and localization of OPN3 and COL-1 (×400)

2.2小干擾RNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中OPN3的表達(dá) 與對照RNAi-control組(48 h)相比，OPN3基因沉默后RNAi-OPN3組mRNA和蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.77，P<0.01)，見圖3。

Note:RNAi-OPN3 compared with RNAi-control，*P<0.05，**P<0.01.The relative mRNA expression level of OPN3 were detected by RT-PCR;The relative protein expression level of OPN3 were detected by Western blot and normalized with β-tublin level；The relative mRNA expression level of COL-1 were detected by RT-PCR; The relative protein expression level of COL-1 were detected by Western blot and normalized with β-tublin level圖3 沉默OPN3后OPN3 mRNA和蛋白的表達(dá)Fig.3 Relative expression level of OPN3 mRNA and protein after silencing OPN3

2.3沉默OPN3對NHDFs膠原蛋白合成的影響 與對照組相比，沉默組RNAi-OPN3組COL-1基因表達(dá)及蛋白表達(dá)量明顯降低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.61，P<0.05)；與對照組(24、48 h)相比，沉默組RNAi-OPN3組COL-1上清液中分泌量明顯減少，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t24 h=7.55、t48 h=4.98，P<0.05)；與對照組相比，沉默組RNAi-OPN3組細(xì)胞免疫熒光COL-1明顯減弱，見圖4。表明OPN3可調(diào)控NHDFs中膠原蛋白的合成。

Note: RNAi-OPN3 compared with RNAi-control，*P<0.05.Procollagen secretion level were detected by ELISA; The expression of COL-1 were detected by immunofluorescence (×400)圖4 沉默OPN3后COL-1合成水平Fig.4 Relative expression level of COL-1 after silencing OPN3

2.4沉默OPN3對NDHFs增殖活力的影響 與RNAi-control組相比，沉默組RNAi-OPN3從24 h起，細(xì)胞增殖活力顯著低于對照組，且抑制效率隨時間增加而升高(t24 h=6.94、t48 h=15.38、t72 h=13.82，P<0.05)，見圖5。為驗證OPN3對細(xì)胞增殖的影響，使用EDU檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)，48 h時染色可見敲低組RNAi-OPN3增殖細(xì)胞比例相比于對照組明顯降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.52，P<0.01),見圖5。表明OPN3參與調(diào)控NHDFs中的增殖活力。

Note: RNAi-OPN3 compared with RNAi-control，**P<0.01.Measure the cell proliferation activity by CCK-8 at 0, 24, 48 and 72 hours; Measure the cell proliferation rate by EDU (×200)圖5 沉默OPN3后檢測細(xì)胞增殖活力Fig.5 Cell proliferation activity was detected after OPN3 was silenced

2.5沉默OPN3對NHDFs細(xì)胞周期的影響 與對照組相比，沉默組RNAi-OPN3組NHDFs細(xì)胞S期比例降低，而G2期細(xì)胞比例升高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(tS期=5.65、tG2期=3.60，P<0.05)，見圖6。表明OPN3可以通過抑制S期細(xì)胞的百分比來抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。

Note: RNAi-OPN3 compared with RNAi-control，*P<0.05，after transfecting cells with OPN3 siRNA and control-siRNA, cell cycle was detected by flow cytometry.圖6 沉默OPN3后檢測細(xì)胞周期Fig.6 Cell cycle was detected after OPN3 was silenced

2.6沉默OPN3對NHDFs遷移能力的影響 與RNAi-control組相比，敲低組RNAi-OPN3遷移細(xì)胞數(shù)目在24、48 h明顯降低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t24 h=32.94、t48 h=11.41，P<0.01),見圖7。

Note：Transfecting cells with siRNA and control-siRNA, cells were stained with crystal violet and counted with Image J at 24 and 48 hours (×100).圖7 Transwell檢測細(xì)胞遷移能力Fig.7 Cell migration detected by transwell

2.7OPN3通過PI3K/AKT信號通路影響膠原蛋白合成 結(jié)果如圖8所示，與RNAi-control組相比，敲低組RNAi-OPN3中p-PI3K/AKT表達(dá)水平明顯降低。AKT抑制劑MK-2206 2HCl在20 μmol/L劑量下顯著抑制AKT磷酸化，實驗表明細(xì)胞合成膠原蛋白水平明顯低于空白對照組及溶解劑DMSO對照組，見圖9。這些數(shù)據(jù)表明，OPN3可能通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的合成。

圖8 干擾OPN3后PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.8 Expression of PI3K/AKT pathway related protein after interference with OPN3

圖9 抑制AKT活化后COL-1合成水平Fig.9 Expression level of COL-1 protein after inhibiting AKT phosphorylation

3 討論

OPNs是一種G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的光敏感受體蛋白，以前報道[8]在人類視網(wǎng)膜的視覺敏感性、晝夜節(jié)律和瞳孔光反射中有著重要作用。近來發(fā)現(xiàn)[8-10]，OPNs不僅分布在眼內(nèi)，其分布范圍廣泛，包括人眼、大腦、睪丸、肝臟、腎臟和皮膚。OPN3是視蛋白家族中的一員，最初在小鼠大腦中被發(fā)現(xiàn)，近來被證明在皮膚細(xì)胞中大量分布[9，14]。筆者的結(jié)果證實OPN3在人真皮成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，但它的功能并不完全清楚。OPN3在各種細(xì)胞中發(fā)揮不同的功能，研究[14]發(fā)現(xiàn)，OPN3參與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，OPN3可調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的色素形成及酪氨酸酶活性[13，15]，OPN3下調(diào)可能通過誘導(dǎo)人表皮黑素細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的凋亡[12]，OPN3還在人表皮微血管細(xì)胞中發(fā)揮不依賴光的作用[11]。那么，OPN3在人真皮成纖維細(xì)胞中可能參與什么功能，本研究圍繞該問題展開探索。

如前所述，人類皮膚膠原蛋白主要由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白構(gòu)成，而Ⅰ型膠原蛋白是最主要的膠原蛋白。在本研究前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，敲低OPN3后，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白在轉(zhuǎn)錄水平均被抑制，但統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅲ型膠原蛋白數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學(xué)意義，故本實驗進(jìn)一步證明OPN3在人真皮成纖維細(xì)胞中調(diào)控成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白合成的功能和可能機(jī)制。本實驗發(fā)現(xiàn)，OPN3敲低后細(xì)胞合成的Ⅰ型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均明顯降低，且ELISA測得分泌膠原蛋白量也明顯下降。OPN3同時也影響成纖維細(xì)胞中其他的細(xì)胞功能，敲低OPN3后，通過CCK-8及EDU檢測細(xì)胞增殖活力，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)OPN3敲低細(xì)胞的增殖活力明顯低于對照組，其S期比例亦明顯低于對照組，細(xì)胞遷移能力也被明顯抑制。所以，筆者推測OPN3參與Ⅰ型膠原蛋白的生成并影響其他細(xì)胞功能。

作為G蛋白偶聯(lián)受體，OPN3在機(jī)體細(xì)胞中，其功能的發(fā)揮涉及多種分子和復(fù)雜的級聯(lián)通路。以往研究[16-18]報告，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT信號通路在細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)廣泛的細(xì)胞機(jī)制，包括存活、增殖、生長、凋亡、代謝、細(xì)胞周期、基質(zhì)沉積等。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，本身具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶的活性，被認(rèn)為是一個重要的酶家族，涉及多種生物過程，AKT也稱為蛋白激酶 B(PKB)，作為PI3K的下游信號蛋白，是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能(包括生存、生長和代謝)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中心。近來研究[16-18]發(fā)現(xiàn)，抑制AKT信號通路火花可抑制細(xì)胞膠原蛋白的合成，而OPN3也被證明可以通過AKT通路調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的凋亡[19]。那么OPN3是否能通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的合成？本研究表明，在敲低OPN3后，p-PI3K/AKT也被顯著抑制；而通過抑制劑抑制AKT活化后，膠原蛋白合成水平也被明顯抑制。這些結(jié)果表明，OPN3是可能通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的合成，影響細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞周期。

綜上，本文主要研究了OPN3在正常人真皮成纖維細(xì)胞中對Ⅰ型膠原蛋白生成的影響，發(fā)現(xiàn)OPN3可能通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原蛋白的合成及分泌。希望本研究能為傷口愈合、醫(yī)療美容及纖維化疾病提供潛在的治療靶點。