劉晗, 劉良肇, 莫林烽, 王娜, 何永華△

1桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院(廣西桂林 541001)； 2廣州華商職業(yè)學(xué)院健康醫(yī)學(xué)院(廣東廣州 511300)

囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)[1-2]屬于膜轉(zhuǎn)運蛋白ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette，ABC)家族，是環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)調(diào)節(jié)的陰離子通道，介導(dǎo)氯離子/碳酸氫鹽通過上皮的轉(zhuǎn)運。CFTR不僅做為一個陰離子通道，而且它可協(xié)調(diào)蛋白網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)。CFTR是在相互作用蛋白的特定動態(tài)系統(tǒng)中運行的，該系統(tǒng)與蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡(luò)連接并受其影響[3]。CFTR抑制或過表達(dá)則會導(dǎo)致細(xì)胞蛋白穩(wěn)態(tài)的嚴(yán)重紊亂。細(xì)胞自噬(autophagy，Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡)作為蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡(luò)的主要參與者，調(diào)節(jié)細(xì)胞對胞質(zhì)蛋白甚至整個細(xì)胞器進行降解和再利用。細(xì)胞自噬機制之一是通過調(diào)節(jié)能量代謝及物質(zhì)代謝來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[4]。因此，研究CFTR與細(xì)胞自噬的作用及其相關(guān)性，可為CFTR及自噬相關(guān)疾病的治療提供特異性作用靶點，為開發(fā)新的藥物提供新思路。本文綜述CFTR與自噬的相關(guān)進展，已通過桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會倫理審核(批文號：QTLL202129)。

1 CFTR概述

1.1 CFTR的結(jié)構(gòu) 囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子的編碼基因及其等位基因定位于7號染色體長臂(7q.31.2)，由27個編碼外顯子組成，約230 kb，是生產(chǎn)和運輸完整和功能性CFTR蛋白所必需的。CFTR蛋白分布廣泛，在所有與吸收和分泌相關(guān)的上皮細(xì)胞頂膜、線粒體等多種細(xì)胞器均有表達(dá)，如氣管、肝、胰腺、小腸、生殖腺等的細(xì)胞膜中[5]。

1.2 CFTR的功能 ABC家族涵蓋CFTR在內(nèi)總計48個成員，在人類中又分為7個亞家族(ABCA-ABCG)。大多數(shù)ABC蛋白作為依賴于ATP的活性轉(zhuǎn)運蛋白進行單向轉(zhuǎn)運[7-8]。CFTR是細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP依賴的ATP門控陰離子通道蛋白，沒有主動轉(zhuǎn)運的功能，其最重要的功能是介導(dǎo)Cl-的跨膜轉(zhuǎn)運，進而在細(xì)胞內(nèi)外形成電化學(xué)濃度梯度，促進H2O和其他離子的轉(zhuǎn)運。膜片鉗技術(shù)[9]是目前分析CFTR陰離子通道分子行為的金標(biāo)準(zhǔn)。

CFTR在氣道、生殖道等多種上皮組織中均起著十分重要的作用，而缺乏CFTR的上皮細(xì)胞[10]會增加分泌物黏度，最終積累并阻塞胃腸道、膽道和生殖道等，產(chǎn)生各種臨床表現(xiàn)。例如，CFTR基因突變引起氯離子通道功能異常，從而影響氯離子和水在男性生殖器細(xì)胞中的正常交換。在這種情況下導(dǎo)致生殖器細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)異常黏稠分泌物，直接破壞精子形成，阻塞輸精管[11-12]。因此，這樣的患者宜通過輔助治療解決生育問題。

1.4 CFTR調(diào)節(jié)劑 CFTR氯離子通道的功能缺陷能夠誘發(fā)多種疾病，例如囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)、特發(fā)性慢性胰腺炎(idiopathic chronic pancreatiti，ICP)、干眼病(keratocon junctivitis sicca，KCS)、多囊腎病(polycystic kidney disease，PKD)、分泌性腹瀉(secretory diarrhea，SD)等疾病?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，CFTR突變已經(jīng)超過1 600種，其中有1 300多種突變能夠?qū)е翪F。因此，CFTR作為治療相關(guān)疾病的藥物靶標(biāo)受到了越來越多人的重視。

1.4.1 CFTR激活劑 目前已發(fā)現(xiàn)的CFTR激活劑主要有三羥基黃酮(genistein)、異鼠李素(isorhamnetin)、毛喉素(forskolin，F(xiàn)SK)等。三羥基黃酮激活氯離子通道的方法有兩種：一是通過提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平；二是通過改變CFTR蛋白構(gòu)象[17]。異鼠李素作為天然產(chǎn)物黃酮醇苷類化合物之一，可以顯著增加CFTR氯離子通道活性且呈劑量依賴性，如測量細(xì)胞頂膜電流以驗證異鼠李素對表達(dá)WT-CFTR的FRT細(xì)胞中CFTR氯離子通道活性的影響，結(jié)果顯示在30 μmol/L時異鼠李素可充分激活CFTR[18]。

1.4.2 CFTR抑制劑 目前對于CFTRinh-172、異甘草素(ISLQ)、羥基酮等CFTR抑制劑的研究相對較多。噻唑烷酮類化合物CFTRinh-172作為研究CFTR功能的金標(biāo)準(zhǔn)，其特點是通過靶向結(jié)合NBD1[19]，抑制氯離子的外流,能夠有效抑制CFTR氯離子通道的活性。ISLQ[20]作為植物衍生的查爾酮類化合物中的一員，不僅能夠抑制CFTR的氯離子通道活性，而且可使細(xì)胞活力和其細(xì)胞內(nèi)cAMP水平無法得到提高，因此被作為治療CFTR突變導(dǎo)致的相關(guān)疾病的主要藥物。

2 自噬

2.1 自噬概述 細(xì)胞自噬是一種十分重要的生物學(xué)現(xiàn)象，是一個將細(xì)胞內(nèi)受損、變性、衰老的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器清除的過程。自噬機制的構(gòu)成部分與多種信號通路以動態(tài)的形式相互作用，以增強細(xì)胞對細(xì)胞自主或環(huán)境應(yīng)激信號的適應(yīng)性[21-22]。自噬的發(fā)生[23]始于細(xì)胞質(zhì)成分和細(xì)胞器被自噬小體的雙膜囊泡包圍而形成的雙膜結(jié)構(gòu)，隨后自噬小體捕獲需降解的某些物質(zhì)將其運輸?shù)饺苊阁w并在溶酶體內(nèi)降解以完成自噬。LC3作為自噬的分子標(biāo)志物在哺乳動物中被ATG7和ATG3所修飾加工，產(chǎn)生LC3-Ⅱ，并將活化的LC3轉(zhuǎn)移到ATG3上，最后與含脂質(zhì)的膜結(jié)合。含有LC3脂質(zhì)的膜可作為支架，構(gòu)建吞噬細(xì)胞的早期自噬元件，該元件可生長成封閉的自噬體。自噬體外膜與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體，這意味著溶酶體內(nèi)被包裹的物質(zhì)被降解并輸出到細(xì)胞質(zhì)中而后進行自我修復(fù)，如此循環(huán)利用以實現(xiàn)細(xì)胞更新[24]。

2.2 自噬調(diào)節(jié)劑

2.2.1 自噬誘導(dǎo)劑 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多自噬誘導(dǎo)因子，但它們的誘導(dǎo)機制仍然不太清楚，可能是因為自噬信號通路之間高度多樣化和復(fù)雜的相互作用。例如，AZD-8055(ATP競爭性mTOR抑制劑)可以在多種癌細(xì)胞株中誘導(dǎo)自噬并抑制增殖[25]；SMK-17以時間依賴性方式誘導(dǎo)MAP1LC3B-Ⅱ/LC3-Ⅱ(微管關(guān)聯(lián)蛋白1輕鏈3β)的產(chǎn)生，其是自噬體形成的指標(biāo)[26]。在存在溶酶體抑制劑巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)的情況下，SMK-17對LC3的轉(zhuǎn)化進一步增加，表明SMK-17激活了自噬通量。

袁堯清等[18]120基于演化經(jīng)濟學(xué)思想探索性地分析了旅游產(chǎn)業(yè)融合通過跨行業(yè)的技術(shù)擴散與組合形成技術(shù)創(chuàng)新效應(yīng)以推動旅游產(chǎn)業(yè)升級的路徑。順此思路，本文進而剖析技術(shù)創(chuàng)新傳導(dǎo)路徑。文化與旅游產(chǎn)業(yè)從形態(tài)分化到要素多尺度融合的動態(tài)過程，特別是技術(shù)融合過程會對文化產(chǎn)業(yè)與旅游產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生知識溢出與技術(shù)改進作用，加強知識創(chuàng)造的規(guī)模經(jīng)濟效應(yīng)和技術(shù)跨行業(yè)溢出的擴散效應(yīng)，降低從產(chǎn)業(yè)間知識鏈分工到產(chǎn)業(yè)內(nèi)知識鏈分工過程中產(chǎn)生的交易成本，從而提升文化旅游產(chǎn)品生產(chǎn)效率，推進旅游產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)高級化。綜上，本文提出：

2.2.2 自噬抑制劑 常用的抑制藥物如下：巴弗洛霉素A1和羥氯喹等藥物可以通過抑制自噬溶酶體的形成來精細(xì)調(diào)節(jié)自噬通量。氯喹(CQ)及其衍生物羥氯喹(HCQ)[27]作為經(jīng)典的自噬抑制劑，通過增加p62的表達(dá)，抑制自噬。DCZ5248是一種新型的自噬抑制劑，其原理跟氯喹相似；實驗結(jié)果顯示DCZ5248(0.3 μmol/L)在結(jié)腸癌細(xì)胞中可誘導(dǎo)細(xì)胞株胞漿空泡形成，LC3 Ⅱ轉(zhuǎn)化，p62蛋白上調(diào)，并抑制晚期自噬[28]。

3 CFTR與自噬的關(guān)聯(lián)

線粒體膜電位異?？捎蒀FTR功能障礙所致，進而損傷線粒體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致ATP合成減少以及ROS生成增加。ROS阻擋細(xì)胞的能量代謝鏈，誘導(dǎo)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2(TGM2)的翻譯后修飾，TGM2作為多功能酶可催化靶蛋白的幾種翻譯后修飾，而后活化的TGM2靶向自噬體形成必需的自噬蛋白Beclin1(BECN1)等多種底物[29-30]。Beclin1與TGM2交聯(lián)后的復(fù)合物被隔離在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中以形成凝聚體。值得一提的是，CFTR、TGM2和自噬參與了一個前饋環(huán)路。這意味著CFTR功能障礙激活了TGM2，使自噬失活，而抑制TGM2和恢復(fù)自噬在細(xì)胞表面重新建立了CFTR功能。CFTR、TGM2和自噬之間的這種密切聯(lián)系可以被認(rèn)為是監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的共同平臺。從這個角度來看，CFTR可以被視為應(yīng)激的主要傳感器，當(dāng)應(yīng)激事件有干擾細(xì)胞生理的風(fēng)險時，它會提醒自噬機制。因此，可以通過刺激CFTR功能、抑制TGM2和刺激自噬來治療囊性纖維化患者。

cAMP作為真核細(xì)胞生物中重要的第二信使，通過下游分子對細(xì)胞的各項生理活動起雙向調(diào)節(jié)作用。CFTR與蛋白激酶 A (PKA)、AMP依賴的蛋白激酶AMPK(AMPK)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)均為cAMP的下游效應(yīng)物,CFTR與cAMP的其他下游效應(yīng)物也可互相作用。PKA通過與CFTR調(diào)節(jié)域的結(jié)合并使其磷酸化以增強其活性，而AMPK則與CFTR的核內(nèi)結(jié)合域結(jié)合，降低其活性[31]，這與PKA對CFTR的影響正好相反。抑制CFTR則降低細(xì)胞PKA活性[32]、提高AMPK活性[33]。PKA和AMPK也與細(xì)胞自噬互相反饋和調(diào)節(jié)[34]。此外，第二信使鈣離子Ca2+是細(xì)胞生存與死亡過程中最重要的調(diào)節(jié)因子之一。當(dāng)其與CFTR協(xié)同作用時，細(xì)胞內(nèi)流離子Ca2+濃度升高，自噬的特異性基因Beclin-1活性增強，自噬相關(guān)蛋白ATG2A表達(dá)水平升高，可誘導(dǎo)自噬發(fā)生[35]。

有研究顯示[36]，對攜帶Ⅱ類CFTR突變的患者使用表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，自噬抑制乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑EP300)進行治療可以延長半胱胺對自噬誘導(dǎo)的有益作用，并恢復(fù)CFTR功能上皮細(xì)胞。NBD1結(jié)構(gòu)域第508位苯丙氨酸殘基(F508del)的缺失是囊性纖維化中最常見的Ⅱ類突變，導(dǎo)致F508del CFTR折疊缺陷。而涉及F508del CFTR的小鼠在經(jīng)過上述聯(lián)合治療(半胱胺加EGCG)后[37]，在Becn1單倍體功能不全(Becn1+/-)的情況下失去了恢復(fù)CFTR功能的能力。因此，自噬是維持細(xì)胞表面功能性CFTR所必需的過程。Liu等[3]用GFP-CFTR F508del轉(zhuǎn)染自噬缺陷IB3-1細(xì)胞24h，Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)p62敲低處理后的CFTRF508del與GFP-CFTR F508del單獨轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比蛋白含量更高；共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，與僅用GFP-CFTRF508del轉(zhuǎn)染的IB3-1細(xì)胞相比，用胱胺處理以及p62敲低處理后質(zhì)膜上的GFP-CFTR F508del增加。以上結(jié)果表明通過Beclin 1過表達(dá)、胱胺或抗氧化劑來拯救細(xì)胞免于自噬，可改善CFTR轉(zhuǎn)運，減少ROS形成和炎癥。該研究結(jié)果同上述觀點一樣證實了自噬對于CFTR的重要性。

線粒體自噬(mitophagy)[38]是一種特異性靶向受損線粒體的自噬反應(yīng)，可以說是最具特征性的選擇性自噬類型，可作為調(diào)控線粒體質(zhì)量的一種機制，因此線粒體自噬可能具有細(xì)胞毒性。清除受損線粒體的關(guān)鍵是線粒體自噬，線粒體在線粒體毒性條件下受到損害，毒性條件包括缺氧和胞質(zhì)Ca2+超載。CFTR在線粒體處有表達(dá)，但其與線粒體自噬的關(guān)系目前尚無相關(guān)文獻報道，仍需要廣大學(xué)者對其進行深入探究。

4 小結(jié)

迄今為止，CFTR基因突變已高達(dá)2 000余種，其臨床表現(xiàn)多樣化。CFTR不僅是ABC大家族中唯一具有通道功能的成員，而且其在癌癥進程相關(guān)的多個信號通路中也起到了重要的調(diào)節(jié)作用，它的突變會增加患癌風(fēng)險并嚴(yán)重威脅人民生命健康。因此，CFTR是許多組織單位持續(xù)探索的重要課題，越來越多的研究者投入到對CFTR的結(jié)構(gòu)、功能、信號通路、小分子調(diào)節(jié)劑等的研究中。但是，目前對于CFTR與細(xì)胞自噬的研究鮮有報道，CFTR在細(xì)胞自噬中的作用及機制仍未明。我國有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在精子活力低下的患者中，低CFTR表達(dá)水平是精子前向運動的有害因素[39]。由此可推測深入對CFTR與精子細(xì)胞自噬的關(guān)系研究或許可為提高精子活力提供新思路。期待更多具有說服力的臨床試驗數(shù)據(jù)對CFTR相關(guān)疾病的預(yù)防與治療以及提出新的藥物靶點等研究提供可靠的理論和實踐的支撐。

利益相關(guān)聲明：本文作者和單位未曾接受第三方資金或服務(wù)支持，無相關(guān)利益沖突。

作者貢獻說明：本文由劉晗進行文獻檢索及撰寫成文；劉良肇、莫林烽、王娜進行資料收集整理；何永華指導(dǎo)論文修改。