胡浩, 張勝利, 邵敏△

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科(安徽合肥 230022)； 2中國人民解放軍海軍安慶醫(yī)院重癥監(jiān)護室(安徽安慶 246000)

膿毒癥是一種由感染引起的危及生命的器官功能障礙，且序貫性器官衰竭評分(sequential organ failure assessment，SOFA)≥2分[1]。膿毒癥可發(fā)生在嚴重創(chuàng)傷、燒傷、多發(fā)傷、休克或大手術后，并迅速從菌血癥發(fā)展到重要器官衰竭，甚至死亡[2]。膿毒癥是對感染免疫反應失調的結果，在膿毒癥的初始階段，活化的單核細胞/巨噬細胞和中性粒細胞釋放多種促炎細胞因子，過度炎癥反應和繼發(fā)性免疫抑制常導致多器官功能衰竭[3]。近年來，許多學者致力于探討基因組學在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展中的作用，已有多項研究表明多種微小RNA(microRNA，miR)參與了膿毒癥免疫細胞的調控，在免疫狀態(tài)的調節(jié)過程中起到了關鍵作用[3-4]。最近的研究[5]表明，miR-147b在膿毒癥患者血漿中表達顯著上調，并且可以作為膿毒癥臨床診斷的有效分子標志物。有學者發(fā)現(xiàn)[6]，miR-147b在由細菌脂多糖刺激的單核細胞中表達異常，并且在血管內皮障礙功能的調控中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討膿毒癥患者外周血單核細胞中miR-147b的表達及其與病情發(fā)展和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年1月至2021年6月于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院就診的46例膿毒癥患者(膿毒癥組)和50例普通感染患者(普通感染組)作為研究對象。46例膿毒癥患者中，男27例，女19例，平均年齡(50.23±8.21)歲；50例普通感染患者中，男30例，女20例，平均年齡(51.62±7.98)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明有可比性。

納入標準：(1)膿毒癥患者符合Sepsis 3.0的診斷標準，普通感染患者指未引起嚴重臟器功能損害的感染者；(2)年齡18～70周歲；(3)搶救存活時間超過24 h；(4)臨床和實驗室資料完整。

排除標準：(1)入院<24 h即死亡或放棄治療者；(2)合并嚴重肝腎疾?。?3)合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病或感染性疾??；(4)長期接受激素或免疫抑制劑治療。

本研究得到了醫(yī)院倫理委員會的支持(批號：安醫(yī)一附院倫審一PJ2022-01-09)，所有患者或家屬均知情同意并簽字。

1.2 方法

1.2.1 血液標本及臨床資料的收集 抽取所有研究對象的空腹外周靜脈血5 mL置于EDTA抗凝管中待用。查閱患者病歷，記錄年齡、性別、感染部位等一般資料。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒檢測研究對象血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)的濃度。計算序貫性器官衰竭評分(sequential organ failure assessment，SOFA)和急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ)。觀察或隨訪膿毒癥患者的28 d預后情況，分為生存組和死亡組。

1.2.2 外周血單核細胞的制備及miR-147b水平的測定 取外周血于4℃條件下以4 000 r/min 離心分離血細胞，加入細胞分離液獲得外周血單核細胞，調整細胞濃度為1×105·L-1待用。向細胞培養(yǎng)板中加入胎牛血清和1640細胞培養(yǎng)液，之后加入外周血單核細胞，放入條件為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，定期觀察細胞生長情況，取對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。應用逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)測定外周血單核細胞中miR-147b的表達水平，應用RNA 提取試劑盒提取外周血單核細胞中總 RNA，采用分光光度計測定RNA的濃度。由上海云序生物科技有限公司設計并合成引物序列，miR-147b引物：正向：5′-TGCTTACGGGCGAATTACATTGT-3′，反向：5′-ATTACCGCATTGGGCTACACG-3′。反應條件如下：95℃預變性10 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，共循環(huán)40次，然后采用熒光定量PCR儀進行定量測定。采用標準曲線法對miR-147b的表達水平進行相對定量分析，采用2-ΔΔCT法計算結果并記錄。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行所有的統(tǒng)計學分析。采用均數(shù)±標準差描述符合正態(tài)分布的定量資料，采用t檢驗進行組間比較；使用頻數(shù)描述分類資料，采用2檢驗進行組間比較。對于符合正態(tài)分布的定量變量間的相關性采用Prearson相關性分析。采用受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線分析miR-147b表達水平對膿毒癥患者預后的預測效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用Kaplan-Meier生存曲線分析不同miR-147b水平膿毒癥患者的預后情況。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膿毒癥組和普通感染組一般資料和血清炎癥因子水平的比較 膿毒癥組和普通感染組患者的年齡、性別、感染部位分布比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；膿毒癥組患者的TNF-α、CRP水平、SOFA評分和APACHEⅡ評分顯著高于普通感染組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 膿毒癥組和普通感染組患者外周血單核細胞miR-147b的表達水平比較 膿毒癥組的外周血單核細胞miR-147b的表達水平為6.54±0.93，顯著高于普通感染組的表達水平(4.10±0.65)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.3 膿毒癥患者外周血單核細胞miR-147b表達水平與血清炎癥因子水平、病情嚴重程度的相關性 膿毒癥患者外周血單核細胞miR-147b表達水平與CRP水平、APACHEⅡ評分呈顯著正相關(r=0.402、0.448，P=0.006、0.004)，而與TNF-α水平、SOFA評分無顯著相關性(r=0.167、0.102，P=0.265、0.501)，見圖2。

表1 膿毒癥組和普通感染組一般資料和血清炎癥因子水平的比較

圖1 膿毒癥組和普通感染組患者外周血單核細胞miR-147b表達水平比較

2.4 膿毒癥不同預后患者一般資料、血清炎癥因子水平和外周血單核細胞miR-147b表達水平的比較 28 d內，膿毒癥患者中共17例(36.96%)死亡，29例(63.04%)存活。死亡組患者的年齡、TNF-α水平、SOFA評分和APACHEⅡ評分顯著高于生存組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而性別、感染部位和CRP水平和在兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。死亡組的外周血單核細胞miR-147b表達水平為7.35±1.12，顯著高于生存組的表達水平(6.06±0.83)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.5 膿毒癥患者預后的多因素logistic回歸分析 以膿毒癥患者預后作為因變量(死亡=1；生存=0)，以單因素分析中有統(tǒng)計學意義的變量作為自變量，進行多因素二元logistic回歸分析，結果顯示，外周血單核細胞miR-147b表達水平及APACHEⅡ評分是膿毒癥患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

圖2 膿毒癥患者外周血單核細胞miR-147b表達水平與TNF-α、CRP、SOFA評分和APACHEⅡ評分的相關性

表2 膿毒癥不同預后患者一般資料和血清炎癥因子水平的比較

2.6 外周血單核細胞miR-147b表達水平預測膿毒癥患者預后的ROC曲線分析 應用ROC曲線分析外周血單核細胞miR-147b表達水平預測患者28 d內死亡的曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.890，95%置信區(qū)間為0.800～0.981(P<0.001)，截斷值為6.86，敏感度和特異度分別為76.5%和86.2%，見圖4。

圖3 死亡組和存活組的外周血單核細胞miR-147b表達水平比較

表3 膿毒癥患者預后的多因素logistic回歸分析

圖4 外周血單核細胞miR-147b表達水平預測膿毒癥患者預后的ROC曲線分析

2.7 不同miR-147b表達水平膿毒癥患者的預后分析 根據(jù)miR-147b表達水平預測膿毒癥患者預后的最佳截斷值將患者分為高水平miR-147b組(>6.86，22例)和低水平miR-147b組(≤6.86，24例)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，高水平miR-147b組患者的28 d累積生存率顯著低于低水平miR-147b組，差異有統(tǒng)計學意義(Log-Rank檢驗：2=4.402，P=0.036)，見圖5。

圖5 不同miR-147b表達水平膿毒癥患者的Kaplan-Meier生存曲線分析

3 討論

膿毒癥是由機體對感染反應失調引起的危及生命的器官功能障礙，是重癥監(jiān)護病房患者常見的死亡原因[7]。目前，膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展機制還未完全明確，研究[8]表明，炎癥反應調控因子引發(fā)的炎癥因子的大量釋放，在膿毒癥的發(fā)生與進展中發(fā)揮著重要作用。miRNA是一種非編碼短鏈RNA，在感染、炎癥和膿毒癥時分泌并釋放到血液中，已被認為是不同炎癥反應的關鍵基因調節(jié)因子[9]。膿毒癥患者外周血中存在大量差異表達的miRNAs[10-11]。最近的研究[5]顯示miR-147b在膿毒癥患者的血漿中表達顯著上調，可作為膿毒癥診斷和預后預測的分子標志物。單核細胞是白細胞的一個亞群，在維持機體穩(wěn)態(tài)、病原體識別和清除以及炎癥反應介導中發(fā)揮著關鍵作用。單核細胞作為抵抗微生物攻擊的第一道防線，在調節(jié)免疫防御反應和維持組織穩(wěn)態(tài)中至關重要。已有多項研究[12-13]顯示，外周血單核細胞中的分子標志物與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展機制有關。因此，本研究探討了膿毒癥患者外周血單核細胞中miR-147b的表達及其與病情發(fā)展和預后的關系。

本研究結果顯示，膿毒癥患者的血清TNF-α、CRP水平、SOFA評分和APACHEⅡ評分顯著高于普通感染組患者，這與之前的研究[8，14]報道的結果一致。膿毒癥組的外周血單核細胞miR-147b的表達水平顯著高于普通感染組的表達水平，并且膿毒癥患者外周血單核細胞的miR-147b表達水平與CRP水平、APACHEⅡ評分呈顯著正相關。之前的研究[15]表明，CRP水平可在一定程度上反映炎癥反應，APACHEⅡ評分可直接體現(xiàn)膿毒癥的嚴重程度。這一結果提示，外周血單核細胞miR-147b的表達水平在膿毒癥患者中表達顯著上調，并且與患者體內炎癥水平及病情嚴重程度有關。Trung等[5]的研究顯示，miR-147b是一種炎癥調控因子，可參與NF-κB信號通路的激活中。眾所周知，NF-κB信號通路是一條重要的免疫及炎癥調控通路，參與介導機體受感染后的炎癥反應，已被證實在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展機制中扮演著重要角色[16-17]。此外，大量研究表明miR-147b與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制及預后有關。Wang等[18]的研究表明，miR-147b在肺腺癌患者中表達上調，且與淋巴結轉移及預后不良有關。Zhang等[19]的研究證實，miR-147b可通過靶向肝細胞癌中的UBE2N促進腫瘤生長增殖。

此外，我們對外周血單核細胞中miR-147b的表達水平與膿毒癥患者預后的關系進行了探討。結果顯示，死亡組的外周血單核細胞miR-147b表達水平顯著高于生存組的表達水平，并且是膿毒癥患者死亡的獨立危險因素。ROC曲線分析結果表明，外周血單核細胞miR-147b表達水平預測患者28 d內死亡的AUC為0.890，敏感度和特異度分別為76.5%和86.2%，因此預測的效能較好。此外，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，高水平miR-147b組患者的28 d累積生存率顯著低于低水平miR-147b組。這一結果提示，外周血單核細胞miR-147b表達水平與膿毒癥患者預后有關，可作為預測預后的分子標志物。

綜上所述，膿毒癥患者外周血單核細胞miR-147b表達水平顯著升高，與血清CRP水平及APACHEⅡ評分有關，并且可作為患者預后的預測標志物。

利益相關聲明：所有作者聲明無相關利益沖突。

作者貢獻說明：胡浩：研究設計、數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫及修改；邵敏，數(shù)據(jù)收集；張勝利，數(shù)據(jù)分析。