武海新，廖晨星，常 毅，馬 慧，劉巧香，李有志，郭 剛*，劉國(guó)世*

1 北京市中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193 2 北京首農(nóng)食品集團(tuán)有限公司，北京 100028 3 山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心，山東濟(jì)南 250109

0 引言

褪黑素（Melatonin，MT）又稱為抑黑素或美拉酮寧，哺乳動(dòng)物體內(nèi)由松果體釋放，廣泛存在與消化道、生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等部位，調(diào)節(jié)動(dòng)物的晝夜節(jié)律，同時(shí)也具有調(diào)節(jié)免疫功能[1]、抗衰老[2]、抗腫瘤[3]、調(diào)節(jié)骨骼生長(zhǎng)[4]等廣泛的生物學(xué)作用。本研究采用動(dòng)物免疫、制備雜交瘤細(xì)胞的方法，制備高特異性褪黑素單克隆抗體。以該褪黑素單克隆抗體為材料，能夠進(jìn)一步開(kāi)發(fā)褪黑素快速檢測(cè)方法，為生物和畜牧領(lǐng)域的科研和生產(chǎn)提供便利。同時(shí)該抗體可作為進(jìn)一步研究褪黑素體內(nèi)外功能及機(jī)理的材料工具，為后續(xù)的科研工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠[6～8 周齡，（18±2）g]，揚(yáng)州大學(xué)提供；褪黑素（CAS號(hào)：73-31-4）、卵清白蛋白（OVA）、EDC、NHS、弗氏佐劑，Sigma公司；羊抗鼠-HRP，南京鐘鼎生物公司；透析袋、0.22 μm無(wú)菌濾器，Millipore公司；高糖DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，南京諾唯贊公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備

將10 mg褪黑素溶解于NaOH水溶液，加熱反應(yīng)6 h，加入鹽酸中和過(guò)量堿，過(guò)硅膠層析柱純化，得到產(chǎn)物8 mg，溶于200 μLDMF中。稱取BSA和OVA各10 mg分別溶于2 mL 0.01 mol/L PBS中，將100 μL衍生物滴加到OVA中，然后各加入10 mgEDC、10 mgNHS，室溫?cái)嚢? h，PBS透析3 天，期間換液6次，取出分裝備用。

1.2.2 動(dòng)物免疫

選取6～8 周齡BALB/c小鼠5 只，將褪黑素-OVA與弗氏佐劑混合，50 μg/只進(jìn)行皮下注射，2～3 周后加強(qiáng)免疫。采血，通過(guò)間接ELISA方法確定抗血清針對(duì)褪黑素-OVA的滴度。

1.2.3 抗血清滴度檢測(cè)及篩選

將褪黑素-OVA用PBS包被液稀釋成1 μg/mL，混勻后加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜；丟棄包被液，洗板3次，每孔加入200 μL封閉液，37 ℃恒溫箱1 h；取出酶標(biāo)板，棄去包被液，洗板1次；將抗血清從1∶500起3 倍梯度稀釋?zhuān)靠准尤?00 μL，37 ℃恒溫箱1 h；將液體丟棄，洗板3次，向每孔中加入100 μL稀釋好的酶標(biāo)二抗（山羊抗鼠-HRP，1∶20 000）；37 ℃恒溫箱1 h；將液體丟棄，洗板4次，每孔加入100 μL TMB顯色液，根據(jù)顏色的深淺決定顯色時(shí)間，一般37 ℃，15 min；每孔加入100 μL 1 mol/L HCL溶液，終止反應(yīng)；即刻在酶標(biāo)儀上讀數(shù)，450 nm處樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽(yáng)性孔。

1.2.4 骨髓瘤細(xì)胞制備

提前1 周用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將SP2/0細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)胞融合當(dāng)天將SP2/0細(xì)胞移入50 mL離心管中，離心1 500 r/min，5 min；丟棄上清，加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.2.5 脾細(xì)胞制備

選擇血清ELISA滴度達(dá)到1∶121 500的小鼠，在融合前3 天終止免疫，腹腔注射褪黑素-OVA 100 μg；融合當(dāng)天將小鼠進(jìn)行安樂(lè)死處死；在75%酒精中浸泡5 min；在無(wú)菌條件下取出脾臟，把脾臟放入培養(yǎng)皿中的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；使用注射器內(nèi)心研磨脾臟，并用細(xì)胞篩過(guò)濾，然后用DMEM沖洗篩網(wǎng)。將過(guò)濾后懸液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，用不含血清的DMEM清洗1次，離心1 500 r/min，5 min；用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，用不含血清的DMEM再清洗1次，離心1 500 r/min，5 min；鋪板計(jì)數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞融合

將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞混合，使脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞數(shù)量比為2∶1；將細(xì)胞移至50 mL離心管中，用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋?zhuān)x心1 500 r/min，5 min，棄去上清，搖動(dòng)離心管使細(xì)胞均勻；用電融合液洗細(xì)胞1次，然后離心1 500 r/min，5 min，棄上清；用電融合液將細(xì)胞稀釋成2×107個(gè)/mL，然后在融合池中加入2 mL細(xì)胞懸液進(jìn)行電融合上機(jī)試驗(yàn)，電擊后靜置10 min；使用高糖DMEM培養(yǎng)基，把融合好的細(xì)胞鋪至96 孔板，每孔100 μL；將96孔板放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；10 天后進(jìn)行融合篩選檢測(cè)。

1.2.7 融合篩選

將褪黑素-OVA用PBS包被液稀釋成1 μg/mL，混勻后加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜。次日吸取100 μL/孔細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)；根據(jù)ELISA結(jié)果，樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽(yáng)性孔；對(duì)二次確認(rèn)后的陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。

1.2.8 細(xì)胞亞克隆

吹打陽(yáng)性孔細(xì)胞并計(jì)數(shù)，使用有限稀釋法對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行稀釋?zhuān)⒔臃N至96孔板。7～10天后在顯微鏡下觀察，檢測(cè)有克隆生長(zhǎng)的孔并做好標(biāo)記，挑取陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞進(jìn)行再次亞克隆，重復(fù)至檢測(cè)達(dá)100%陽(yáng)性后，挑出單克隆孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.2.9 亞克隆篩選

操作方法同1.2.7。

1.2.10 抗體純化

在親和純化層析柱中裝入Protein A瓊脂糖凝膠介質(zhì)，將3G3D1細(xì)胞上清緩慢上樣，待抗體結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，即得到所需純化抗體，在PBS中進(jìn)行4 ℃透析過(guò)夜，次日進(jìn)行純度與濃度測(cè)定。

1.2.11 抗體鑒定

通過(guò)ELISA檢測(cè)純化抗體滴度，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定所得抗體濃度。

1.2.12 純化抗體ELISA滴度檢測(cè)

操作方法同1.2.3。

1.2.13 抗體純度鑒定

純化后抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠抗血清滴度檢測(cè)

通過(guò)對(duì)5 免后鼠抗血清與褪黑素-OVA滴度檢測(cè)，1#、3#小鼠抗血清針對(duì)褪黑素-OVA滴度能夠達(dá)到121 500，2#、4#、5#小鼠抗血清針對(duì)褪黑素-OVA滴度能夠達(dá)到40 500（表1）。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法確定抗血清針對(duì)褪黑素競(jìng)爭(zhēng)抑制率，3#小鼠抗血清針對(duì)褪黑素有競(jìng)爭(zhēng)性（表2）。

表1 5免后7 天對(duì)小鼠血清抗體滴度檢測(cè)結(jié)果

表2 5免后7 天小鼠血清競(jìng)爭(zhēng)滴度檢測(cè)結(jié)果

2.2 融合細(xì)胞篩選

將骨髓瘤細(xì)胞和免疫小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行電融合，鋪板10 天后進(jìn)行ELISA篩選檢測(cè)。通過(guò)兩輪ELISA篩選，得到5 株OD值高于0.5的融合細(xì)胞（1H12、2C5、2C9、3G3、4C11）（表3）。進(jìn)一步通過(guò)ELISA篩選檢測(cè)，獲得1 株針對(duì)褪黑素-OVA特異性最高的融合細(xì)胞株（3G3）（表4）。

表3 融合細(xì)胞ELISA篩選結(jié)果

表4 融合細(xì)胞上清競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選結(jié)果

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立

將骨髓瘤細(xì)胞和免疫小鼠脾細(xì)胞融合后，經(jīng)過(guò)3 輪細(xì)胞亞克隆和ELISA篩選（表5），獲得針對(duì)褪黑素-OVA具有高特異性的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株5 株（3G3B2、3G3C7、3G3D1、3G3F4、3G3G3）（圖1）。

表5 亞克隆細(xì)胞上清競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選結(jié)果

圖1 篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞

2.4 純化抗體滴度鑒定

選擇3G3D1這株單克隆細(xì)胞株進(jìn)行抗體純化。經(jīng)ELISA滴度檢測(cè)可達(dá)1∶64 000，純化抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果如表6所示。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)純化后抗體進(jìn)行濃度測(cè)定，所得3G3D1-抗體濃度為0.28 mg/mL，體積4 mL。

表6 3G3D1純化抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

2.5 抗體純度鑒定

3G3D1純化抗體SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，出現(xiàn)55 kD、25 kD兩個(gè)條帶，符合IgG重鏈與輕鏈分子大?。▓D2）。

圖2 純化抗體SDS-PAGE分析

3 討論

褪黑素分子量為232.28 Da。作為一種小分子物質(zhì)，褪黑素屬于半抗原，無(wú)法直接刺激動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答從而產(chǎn)生特異性抗體[5]，因此需要先與蛋白載體相結(jié)合，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物的免疫過(guò)程[6]。本研究中將褪黑素小分子與卵清蛋白OVA進(jìn)行偶聯(lián)，制備出褪黑素-OVA抗原，并通過(guò)5 輪免疫成功得到了血清滴度過(guò)關(guān)的免疫小鼠，并且分離小鼠脾臟制備雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)過(guò)篩選共獲得5 株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，均可穩(wěn)定分泌褪黑素單克隆抗體。由于3G3D1細(xì)胞株對(duì)褪黑素-OVA抗原的識(shí)別能力最強(qiáng)，因此使用這株細(xì)胞進(jìn)行抗體純化，最終得到單克隆抗體濃度為0.28 mg/mL，滴度可達(dá)1∶64 000。因此本研究成功制備出針對(duì)褪黑素小分子物質(zhì)的高特異性單克隆抗體。

褪黑素是一種哺乳動(dòng)物體內(nèi)常見(jiàn)的抗氧化劑和抗炎物質(zhì)[7]，同時(shí)也是調(diào)控生殖的重要激素[8]。本研究制備出褪黑素單克隆抗體，為褪黑素含量的快速檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)提供材料，也為相關(guān)功能性研究奠定基礎(chǔ)。