沈紫霞，常 毅，劉巧香，郭 剛，馬 慧，李有志，廖晨星*，劉國世*

1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193 2 北京首農(nóng)食品集團有限公司，北京 100028 3 山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心，山東濟南 250109

0 引言

褪黑素（Melatonin，MT），化學(xué)名為N-乙?；?5-甲氧基色胺，屬于吲哚類色胺，一種主要由松果腺分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素[1]。褪黑素不僅在催眠、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤方面有一定成效[1]，還可以維持機體內(nèi)的代謝穩(wěn)定[2]；在實際生產(chǎn)中，褪黑素對降低牛奶中體細(xì)胞數(shù)、改善乳品質(zhì)方面有著顯著的效果[3]。然而在許多國家和地區(qū)，人工合成的褪黑素是不能作為添加劑存在的，因此許多研究者都開始關(guān)注天然生物褪黑素產(chǎn)品這一研究熱點[4]。作為大眾消費最多的乳制品，牛奶含有天然褪黑素，是外源性褪黑素的良好補充來源。在動物機體內(nèi)，褪黑素進(jìn)入血液循環(huán)后會經(jīng)脈絡(luò)膜濃縮，再分泌進(jìn)入腦脊液與血漿蛋白結(jié)合，并以這種形式被運輸至各個組織或器官，發(fā)揮相關(guān)作用[5]，因此褪黑素的作用是多方面的。有研究表明，褪黑素可以調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和抗氧化，對生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)存在積極影響[6]。天然高褪黑素奶對人和動物都具有重要的生物學(xué)意義，如果可以通過合適的檢測方法鑒定出褪黑素含量高的牛奶，并以此哺乳犢牛，可能會更有利于犢牛的生長發(fā)育[3]。但具體結(jié)論仍需進(jìn)一步探索。隨著有關(guān)生產(chǎn)天然高褪黑素奶的研究增多[7]，人們在尋找更高效便捷的褪黑素檢測方法上存在一定的迫切性。傳統(tǒng)的褪黑素含量檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）、放射免疫測定法（RIA）以及酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）、紫外分光光度計法（UV）等[8]。本文就以上幾種傳統(tǒng)的褪黑素含量檢測方法展開綜述，介紹并對比其原理、優(yōu)缺點以及應(yīng)用范圍，為今后天然高褪黑素奶的篩選提供一定技術(shù)支持。

1 褪黑素檢測方法

1.1 氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜法（GC）是一種以氣體為流動相的柱色譜法，根據(jù)所用固定相狀態(tài)的不同可分為氣-固色譜（GSC）和氣-液色譜（GLC）[9]。質(zhì)譜分析法主要是根據(jù)被測樣品離子的質(zhì)荷比來進(jìn)行分析[9]。采用氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定褪黑素時，毛細(xì)管柱和程序升溫較為常用，如以15℃/min的升溫速率從60 ℃升至280 ℃并持續(xù)5 min，或是在90 ℃持續(xù)1 min后再升溫至275 ℃并持續(xù)10 min。載體通常選擇電離電位較高的氣體（如氦氣），質(zhì)譜均采用電子轟擊70 eV離子源。在上述條件下，樣品中的褪黑素、其他藥物和雜質(zhì)能夠完全分離并得到各自的MS圖[10]。采用外標(biāo)法或是同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行峰面積定量[11]。

該方法有以下幾點優(yōu)勢：（1）分析速度快、分離效率高：由于樣品在氣相中傳遞時的快速性，樣品組分在流動相和固定相之間可以瞬間達(dá)到平衡狀態(tài)；（2）適用范圍廣：氣相色譜法中可選作固定相的物質(zhì)有很多；（3）靈敏度高：氣相色譜法可與高靈敏選擇性檢測器結(jié)合使用[9]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在生物樣品中的檢測限可達(dá)1 pg/mL。但這類方法也存在一些缺點，比如無法直接測定難揮發(fā)物及選擇性差[12]，在檢測過程中需要衍生，耗時較長等[13]。

1.2 高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

在諸多褪黑素測定方法中，高效液相色譜法（HPLC）是使用最廣泛的[14]。它的原理是以液體作為流動相，用高壓輸液系統(tǒng)把不同極性的緩沖液、溶劑等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離，隨后進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)對樣品的分析[15]。高效液相色譜測定通常采用反向C18填料，大多采用70∶30到50∶50的甲醛-水作為流動相[16]，另外也有使用磷酸鹽緩沖液-乙腈[17]的。由于褪黑素的極性較小，流動相的pH對色譜影響不大，一般采用流動相pH范圍為3～4，多采用磷酸鹽、冰乙酸等控制[18]。檢測生物樣品（如牛奶）時，由于紫外檢測器的靈敏度較低，一般不采用，常采用靈敏度較高的電化學(xué)檢測器（ED）或熒光檢測器（FD）。高效液相色譜測定褪黑素時通常采用外標(biāo)法定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線在較大濃度范圍具有良好的線性[19]。

高效液相色譜具有高效、高速以及高分辨力等優(yōu)點，與合適的檢測器聯(lián)用后牛奶中褪黑素檢測限可達(dá)1 μg/mL[20]，但該法的前處理步驟繁瑣、耗時長[13]。高效液相色譜通常與質(zhì)譜分析法聯(lián)用，即高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，其分離度和靈敏度比高效液相色譜更高[13]，對空氣中目標(biāo)物的檢出限可達(dá)0.2 ng/mL[21]，牛奶中褪黑素的檢測限數(shù)量級在10 pg/mL，且該法也具有更廣的使用范圍。

1.3 放射免疫測定法

放射免疫分析（RIA）的本質(zhì)是標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對特異抗體的競爭性抑制反應(yīng)[22]。褪黑素的放射免疫分析測定是利用標(biāo)記褪黑素與特異的免抗血清結(jié)合，在反應(yīng)平衡后加入待測樣品，溫度恒定在4 ℃，待反應(yīng)充分平衡再進(jìn)行分離并測量計數(shù)[22]。放射免疫分析測定法的操作步驟包括抗原的制備與標(biāo)記、特異性抗體的制備以及抗原抗體復(fù)合物與游離抗原的分離。當(dāng)需要同時測定大量樣品時，一般選擇放射免疫測定法[8]。該法中的125I-褪黑素這類抗原在應(yīng)用前需要進(jìn)行氧化制備及高效液相色譜分離；而抗原3H-褪黑素則需要脂、水兩溶的閃爍液激發(fā)測定[22]。

放射免疫測定法優(yōu)點在于褪黑素不必提純就可以測量，同時能達(dá)到較高的靈敏度，檢測限可達(dá)1 pg/mL[23]，重現(xiàn)性也不錯[22]。但不足之處在于其測量值僅代表免疫學(xué)活性，檢測過程中會使用放射性同位素，而且它的測定不易被標(biāo)準(zhǔn)化[24]。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型免疫測定技術(shù)[22]，它的原理在于將抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合[25]。這種方法既可以用來測定抗原也可以用來測定抗體。在反應(yīng)過程中，對固相載體上的酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合量等進(jìn)行統(tǒng)計、分析，通過洗滌處理去除反應(yīng)液中的其他物質(zhì)，在加入酶反應(yīng)底物后，底物可以通過酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩a(chǎn)物，最后采用定性或定量分析的方式，對有色產(chǎn)物量進(jìn)行檢驗分析，以達(dá)檢測目的[26]。鑒于其高靈敏性，近年來逐漸有研究者采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定牛奶中褪黑素的含量[27]。根據(jù)具體操作過程不同，酶聯(lián)免疫吸附測定分為多種類型，如雙抗體夾心測抗原、雙抗原夾心測抗體以及競爭法測抗體或抗原等都是常見的幾類酶聯(lián)免疫吸附測定法。

酶聯(lián)免疫測定技術(shù)的敏感性高，檢出限為每孔0.2 pg[8]，反應(yīng)物穩(wěn)定性較高，相對放射免疫測定法來說不存在放射性危險。但這種方法對實驗設(shè)備和操作的高要求性限制了其應(yīng)用范圍[22]。

1.5 紫外分光光度法

紫外分光光度法（UV）是根據(jù)組分含量與吸收光譜呈線性關(guān)系進(jìn)行分析，它一般與多種化學(xué)信息學(xué)方法相結(jié)合，從而對多組分混合物進(jìn)行定性定量分析[28]。由于褪黑素易溶于甲醇、不溶于水，因此在使用紫外分光光度計法測定褪黑素時，可以直接以甲醇作為溶劑來進(jìn)行超聲提取，也可以直接采用無水乙醇為溶劑提取（保證振蕩充分）。當(dāng)待測樣的輔料為微晶纖維素、淀粉、碳酸氫鈣等物質(zhì)時，可以使用紫外分光光度計法，不會干擾測定。但當(dāng)輔料成分比較復(fù)雜或含有其他吲哚類藥物時，對待測樣品處理的要求會比較高，這種情況往往不建議使用該法。因此在褪黑素的含量測定中，紫外分光光度計法一般只用于制劑輔料較為簡單的情況，再結(jié)合導(dǎo)數(shù)分光光度法，能得到較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。褪黑素在紫外光波長為223 nm和277 nm處有最大吸收，目前常選用277 nm作為檢測波長[8]。同時采用外標(biāo)法定量，能夠具有良好的線性。

由此可見，紫外分光光度計法的優(yōu)點在于可以對多組分混合物進(jìn)行分析測定，結(jié)果也較為準(zhǔn)確可靠，最低檢測限為0.025 μg／mL[8]。但該法對待測樣品要求較高，樣品成分較復(fù)雜的情況下不推薦。

2 小結(jié)

在上述提到的幾種測褪黑素的方法中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的靈敏度高于氣相色譜法和高效液相色譜法。與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法相比，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在特異性、適用性以及樣品檢測量方面都存在較大的優(yōu)勢。但這幾種方法也存在耗時較長、成本相對高的弊端。與之相反的是放射免疫測定法，對于待測樣品中的褪黑素不必提純就能進(jìn)行測量，比較適合樣本量較大的情況，目前放射免疫試劑盒的應(yīng)用也相對比較普及了。但放射免疫測定法的測定不易標(biāo)準(zhǔn)化，測值可靠度不全面。酶聯(lián)免疫吸附法不存在放射性危險，且該技術(shù)敏感度較高，但由于實驗設(shè)備及操作的原因無法廣泛使用。紫外分光光度計法只適合成分較簡單的待測樣品，如褪黑素片劑或膠囊，這類樣品輔料成分簡單，不存在干擾結(jié)果的情況；像牛奶這類成分較復(fù)雜的生物樣品一般選用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法較為合適。