董麗英,趙秀蘭,劉 沛,劉樹(shù)芳,張先聞,3,楊勤忠

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)跨境有害生物綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650205;2. 滄源縣植保植檢站,云南 滄源 677400;3. 云南大學(xué)資源植物研究院,昆明 650091)

【研究意義】由稻瘟病菌(PyriculariaoryzaeCav.)引起的水稻稻瘟病是水稻安全生產(chǎn)的重要限制因子,發(fā)病嚴(yán)重的田塊可造成水稻絕收,“水稻-稻瘟病菌”的互作研究已成為寄主-病原微生物病害系統(tǒng)互作研究的模式系統(tǒng),寄主抗性基因與病菌無(wú)毒基因間遵循基因?qū)虻幕プ髂Ｊ絒1-2]。生產(chǎn)實(shí)踐證明,控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效及環(huán)保的措施就是抗病品種的合理利用。由于田間稻瘟病病原菌種群結(jié)構(gòu)的多樣性及生理小種組成的復(fù)雜性,加之人們對(duì)水稻抗性基因缺乏有效利用,新選育的抗病品種往往在推廣幾年后喪失抗性[3-4],這已成為育種家亟待解決的棘手問(wèn)題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在國(guó)內(nèi),利用含有不同抗稻瘟病基因的水稻單基因系測(cè)定稻瘟病菌致病性已得到廣泛研究。周江鴻等[5]對(duì)吉林、遼寧、河北等10個(gè)省322個(gè)稻瘟病菌單孢菌株的毒性基因及其地理分布進(jìn)行分析,明確了毒性基因在南方秈稻區(qū)和北方粳稻區(qū)的出現(xiàn)頻率與相應(yīng)抗病基因的秈稻、粳稻來(lái)源沒(méi)有相關(guān)性;蘭波等[6]對(duì)江西省195個(gè)稻瘟病菌株進(jìn)行測(cè)定表明,基因Pizt、Pi1、Piz-5、Piz表現(xiàn)較高的抗性頻率;馬軍韜等[7]測(cè)定了黑龍江省不同來(lái)源稻瘟病菌的致病性,僅基因Pi9的抗性頻率較高;鄧云[8]對(duì)2018—2020年福建省稻瘟病菌單孢菌株進(jìn)行毒力頻率測(cè)定的結(jié)果顯示,基因Piz-5、Pi9、Pikh、Pi1的抗性頻率最高;此外,在鄂西南地區(qū)、廣東地區(qū)也選擇了部分水稻單基因系作為鑒別寄主,對(duì)分離自不同主栽品種上稻瘟病菌的致病性進(jìn)行了有效評(píng)價(jià)[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】云南多元的傳統(tǒng)文化促進(jìn)了當(dāng)?shù)孛褡宓咀鬟z傳的多樣性[11]。與緬甸接壤的云南省臨滄市居住著23個(gè)少數(shù)民族,位于云南省西南邊境,其稻作類(lèi)型及地方品種資源豐富。本研究用分離自臨滄地區(qū)6個(gè)縣水稻主栽品種上的26個(gè)稻瘟病菌單孢菌株,以及分別從滄源縣和鎮(zhèn)康縣2個(gè)邊境縣的陸稻地方品種上分離的56和26個(gè)稻瘟病菌單孢菌株,通過(guò)苗期人工接種方法,對(duì)23個(gè)稻瘟病抗性單基因系的抗感反應(yīng)開(kāi)展稻瘟病菌致病性和聚類(lèi)分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確不同來(lái)源稻作產(chǎn)區(qū)的已知稻瘟病抗性基因的抗性水平,對(duì)利用已知抗性基因開(kāi)展抗病新品種選育、指導(dǎo)新品種合理布局及控制稻瘟病流行具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,為臨滄地區(qū)的糧食安全生產(chǎn)提供重要保障;通過(guò)對(duì)供試菌株的聚類(lèi)分析,了解不同來(lái)源菌株群體間致病性的分化情況,同時(shí)也為開(kāi)展廣譜抗性基因挖掘提供可利用菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株: 3個(gè)稻瘟病菌群體由108個(gè)菌株組成,于2017年由稻瘟病抗性研究團(tuán)隊(duì)從臨滄地區(qū)的水稻主栽品種和陸稻地方品種上分離得到,其中從臨滄地區(qū)(云縣、滄源縣、鳳慶縣、雙江縣、耿馬縣及永德縣)主栽品種(‘II優(yōu)838’‘兩優(yōu)2161’‘宜香2292’‘宜香99E-4’‘豐優(yōu)22’‘宜香707’‘宜香3003’‘滇雜’‘宜香725’)穗頸瘟上分離到26個(gè)單孢菌株,從滄源縣陸稻地方品種(‘硪茸’‘硪倆’‘考撇糯’‘大花谷’‘扎硪倆’‘小紅谷’)穗頸瘟上分離到56個(gè)單孢菌株,從鎮(zhèn)康縣陸稻地方品種(‘彎甸糯’‘細(xì)紅谷’‘小紅谷’‘壓草糯’)穗頸瘟上分離到26個(gè)單孢菌株(表1)。

表1 108個(gè)稻瘟病菌單孢菌株來(lái)源

供試水稻:持有不同抗病基因的23個(gè)水稻稻瘟病抗性單基因系和感病對(duì)照水稻品種麗江新團(tuán)黑谷(CK)均由IRRI的N．Kobayashi 博士提供。

1.2 試驗(yàn)方法

水稻單基因系的育苗、病原菌的培養(yǎng)、產(chǎn)孢、接種及調(diào)查參考董麗英等[12]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1 供試菌株群體對(duì)不同抗性單基因系的毒性頻率 供試菌株群體對(duì)持有不同抗性基因的單基因系致病性強(qiáng)弱通過(guò)毒性頻率(Virulence frequency,VF)表示,具體計(jì)算見(jiàn)公式(1),稻瘟病菌群體的毒性頻率及毒力類(lèi)型劃分參考周江鴻等[5]的方法。

毒性頻率(%)=(供試致病菌株數(shù)/供試總菌株數(shù))×100

(1)

1.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)不同抗性單基因系對(duì)108個(gè)稻瘟病菌單孢菌株的抗性反應(yīng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。并采用馬軍濤等[7]的方法構(gòu)建獲得數(shù)據(jù)的0～1數(shù)據(jù)庫(kù),抗病反應(yīng)型記為“1”,感病反應(yīng)型記為“0”。利用分子生物學(xué)分析軟件NTSYSPC 2.10e[13]的非加權(quán)組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)對(duì)108個(gè)單孢菌株在23個(gè)稻瘟病抗性單基因系上的抗感情況進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株對(duì)水稻單基因系的毒性頻率分析

利用108個(gè)稻瘟病菌供試單孢菌株分別接種于3.5葉期的23個(gè)稻瘟病抗性單基因系,從表2可知,分離自臨滄地區(qū)水稻主栽品種的26個(gè)稻瘟病菌單孢菌株對(duì)含有Piz、Piz-5、Pita、Pi5、Pi9和Pita-26個(gè)抗性基因的水稻單基因系的毒性頻率均低于20%,可以在臨滄主栽品種種植區(qū)利用這些抗性基因,占供試單基因系的26.09%;分離自滄源縣陸稻地方品種的56個(gè)稻瘟病菌單孢菌株對(duì)含有Pik-h、Piz-t、Pib、Pi5、Pi9、Pi12和Pi117個(gè)抗性基因的水稻單基因系的毒性頻率均低于20%,可以在滄源縣陸稻地方品種種植區(qū)利用這些抗性基因,占供試單基因系的30.43%;分離自鎮(zhèn)康縣陸稻地方品種的26個(gè)稻瘟病菌單孢菌株對(duì)含Pii、Pik-h、Piz-t、Pib、Pish、Pi1、Pi5、Pi9、Pi12、Pik-m和Pi1111個(gè)抗性基因的水稻單基因系的毒性頻率均低于20%,可以在鎮(zhèn)康縣種植陸稻地方品種種植區(qū)利用這些抗性基因,占供試單基因系的47.83%。不同來(lái)源供試菌株對(duì)持有Pi5和Pi9抗性基因的水稻單基因系的毒性頻率分別低于15.38%和3.85%。表明這2個(gè)抗性基因在整個(gè)臨滄地區(qū)都可以加以利用。

表2 臨滄地區(qū)108個(gè)稻瘟病菌單孢菌株對(duì)23個(gè)稻瘟病抗性單基因系的毒性頻率

續(xù)表2 Continued table 2

2.2 不同來(lái)源的供試菌株致病性相似性分析

將來(lái)自臨滄地區(qū)不同品種的108個(gè)稻瘟病菌單孢菌株對(duì)23個(gè)稻瘟病抗性單基因系的毒性測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析。從圖1可見(jiàn),當(dāng)?shù)疚敛【虏⌒韵嗨葡禂?shù)為0.45時(shí),108個(gè)供試菌株的致病性可以分化為2類(lèi),I類(lèi)含有28個(gè)菌株,其中25個(gè)菌株分離自臨滄地區(qū)水稻主栽品種,3個(gè)菌株分離自鎮(zhèn)康縣陸稻地方品種;II類(lèi)含有80個(gè)菌株,其中56個(gè)分離自滄源縣陸稻地方品種,23個(gè)分離自鎮(zhèn)康縣陸稻地方品種以及1個(gè)分離自臨滄地區(qū)水稻主栽品種。108個(gè)供試菌株可以分為98種致病類(lèi)型,其中稻瘟病菌單孢菌株LC1和LC3,LC6和LC83,LC14和LC20,LC30和LC35,LC41和LC47, LC48和LC59,LC38和LC93, LC86和LC98,LC42、LC46和LC57分別對(duì)23個(gè)稻瘟病抗性單基因系具有相同的致病類(lèi)型,但來(lái)源不同的部分菌株對(duì)23個(gè)稻瘟病抗性單基因系也有共有的致病類(lèi)型。例如,來(lái)源于臨滄地區(qū)水稻主栽品種的菌株LC6和來(lái)源于鎮(zhèn)康縣陸稻地方品種的菌株LC83,來(lái)源于滄源縣陸稻地方品種的菌株LC38和來(lái)源于鎮(zhèn)康縣陸稻地方品種的菌株LC93;更多具有相同致病類(lèi)型的菌株往往具有相同來(lái)源。

圖1 108個(gè)稻瘟病菌單孢菌株對(duì)23個(gè)稻瘟病抗性單基因系親和反應(yīng)型的聚類(lèi)分析Fig.1 Clustering analysis of compatible response of 108 P.oryzae isolates to 23 monogenic lines

3 討 論

開(kāi)展田間收集的稻瘟病菌單孢菌株的毒性頻率測(cè)定分析不僅可以明確菌株的毒性及田間構(gòu)成情況,同時(shí)可反映出不同抗性基因的抗性水平[4-5, 14];臨滄水稻種植區(qū)以種植秈稻為主,分離自臨滄水稻主栽品種的26個(gè)單孢菌株的致病研究結(jié)果表明,臨滄地區(qū)的這些菌株除了對(duì)已知Pik-h的毒性頻率為38.46%以外,對(duì)已知Piz、Piz-5、Pita、Pi5、Pi9和Pita-26個(gè)抗性基因的毒性頻率低于20%;而董麗英等[12]研究發(fā)現(xiàn),云南省秈稻區(qū)稻瘟病菌群體對(duì)已知Pik-h、Piz、Piz-5、Pita、Pi5、Pi9和Pita-27個(gè)抗性基因的毒性頻率低于20%。說(shuō)明在秈稻區(qū)主栽品種上Pik-h抗性基因的抗性頻率正在降低,臨滄水稻種植區(qū)應(yīng)慎重利用該抗病基因。

采用同一套鑒別寄主對(duì)不同時(shí)期采集的病原菌進(jìn)行致病性分析,可明確其發(fā)生致病性變異的情況[15]。2017年分離自滄源縣和鎮(zhèn)康縣陸稻地方品種上的菌株與2014年分離自滄源縣和耿馬縣陸稻地方品種上的菌株,對(duì)含有已知抗性水稻單基因系的毒性頻率大體一致[16]。說(shuō)明分離自臨滄地區(qū)陸稻地方品種菌株致病型相對(duì)穩(wěn)定,這與李海倫等[17]在研究水稻地方品種不同品系對(duì)田間稻瘟病菌群體遺傳多樣性的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)具有豐富遺傳多樣性的傳統(tǒng)地方品種促進(jìn)了稻瘟病菌相對(duì)穩(wěn)定的選擇,傳統(tǒng)地方品種與病原菌處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)的結(jié)論一致。

從水稻主栽品種和2個(gè)陸稻地方品種上分離的菌株除了對(duì)Pi5和Pi9抗性基因的毒性頻率都小于20%外,其它水稻主栽品種推廣的地區(qū)可利用的4個(gè)抗性基因與陸稻地方品種種植區(qū)可利用的抗性基因都不相同,說(shuō)明不同品種來(lái)源的菌株致病性差異較大;滄源縣可利用的7個(gè)抗性基因在鎮(zhèn)康縣均可使用,這可能與不同區(qū)域種植的水稻品種的抗性遺傳背景、氣候類(lèi)型、種植方式和栽培管理有關(guān)[17]。108個(gè)供試菌株對(duì)23個(gè)稻瘟病抗性單基因系的抗感進(jìn)行聚類(lèi)分析表明,在致病性相似系數(shù)為0.45時(shí),這些菌株分為兩類(lèi),一類(lèi)以水稻主栽品種為主,28個(gè)菌株中含有25個(gè)來(lái)自水稻主栽品種的菌株,另一類(lèi)以陸稻地方品種為主,80個(gè)菌株中除了1個(gè)菌株來(lái)自主栽品種外,其余79個(gè)稻瘟病菌株都是來(lái)自陸稻地方品種的菌株,說(shuō)明分離自水稻主栽品種和陸稻地方品種上稻瘟病菌株的致病性存在明顯分化,新致病類(lèi)型的產(chǎn)生需要有效抗性基因的合理利用來(lái)控制稻瘟病的發(fā)生。分析現(xiàn)代栽培稻中正在利用的抗性基因并發(fā)掘可利用的抗源是解決品種抗性的基礎(chǔ)[18-19];而從地方品種資源及其野生近源種中挖掘高抗稻瘟病的新基因應(yīng)用于現(xiàn)代育種是拓寬栽培稻遺傳基礎(chǔ)的重要手段,也是解決當(dāng)前水稻主栽品種遺傳基礎(chǔ)狹窄的有效途徑[20-21]。

4 結(jié) 論

明確了臨滄地區(qū)不同抗稻瘟病基因的利用價(jià)值,Pi5和Pi9抗性基因在臨滄的水稻種植區(qū)具有較好的應(yīng)用價(jià)值,是當(dāng)前抗病育種的重要抗源;分離自臨滄地區(qū)水稻主栽品種和陸稻地方品種的稻瘟病菌群體存在明顯的致病性分化,而來(lái)自滄源縣和鎮(zhèn)康縣陸稻地方品種的菌株致病性分化相對(duì)較小。