朱 晨,唐 偉,陰 筱,董玲霞,孫厚俊

(1.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 徐州 221131;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所,濟(jì)南 250100)

【研究意義】美人蕉(CannaindicaL.)屬于美人蕉科(Cannaceae)美人蕉屬(Canna),是起源于中美洲和南美洲等熱帶地區(qū)的單子葉多年生草本植物[1]。美人蕉適應(yīng)性強(qiáng),栽培管理便利,在世界各地均有栽種,主要用作觀賞植物。在南美和東南亞,美人蕉根莖還被用于食品加工[1-2]。目前,美人蕉在我國常用做園林綠化植物,在各地廣泛種植[3]。近年研究發(fā)現(xiàn),美人蕉含有黃酮類、異戊二烯聚合物、生物堿、蛋白質(zhì)、糖苷、皂苷、單寧等物質(zhì),具有較高藥用價(jià)值[4]。美人蕉病毒病是美人蕉的一種重要病害,可導(dǎo)致美人蕉出現(xiàn)條紋狀花葉、壞死等癥狀,嚴(yán)重影響美人蕉的商品屬性和觀賞價(jià)值。因此,診斷侵染美人蕉的病毒種類,分析病毒序列特征,明確病毒進(jìn)化關(guān)系,對(duì)我國美人蕉病毒病害防控研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前,全世界已報(bào)道侵染美人蕉的病毒共有6種,分別是美人蕉黃斑駁病毒(Canna yellow mottle virus, CaYMV)[5]、菜豆黃花葉病毒(Bean yellow mosaic virus, BYMV)[6]、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)[7]、甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)[8]、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus, TAV)[9]和美人蕉黃條病毒(Canna yellow streak virus, CaYSV)[10]。其中CaYSV是馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員,可以通過蚜蟲進(jìn)行非持久性傳播,也可以通過機(jī)械摩擦進(jìn)行傳播[1]。在實(shí)驗(yàn)室接種環(huán)境下,CaYSV也可以侵染本氏煙(Nicotianabenthamiana)、昆諾阿藜(Chenopodiumquinoa)和四季豆(Phaseolusvulgaris)[1]。由于美人蕉主要通過根莖扦插等營養(yǎng)手段進(jìn)行無性繁殖,隨著商品流通性不斷加快,使得CaYSV的發(fā)病和擴(kuò)散能力具有更大威脅。目前,CaYSV已在英國、美國、以色列、俄羅斯等不同國家的美人蕉品種中被發(fā)現(xiàn)[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期對(duì)CaYSV的研究大多數(shù)集中在國外,國內(nèi)僅對(duì)CaYSV的檢測技術(shù)有報(bào)道[11],但對(duì)CaYSV基因組序列特征、遺傳進(jìn)化及重組分析研究未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用RT-PCR和RACE技術(shù)對(duì)揚(yáng)州和長沙2個(gè)地區(qū)美人蕉上CaYSV全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增,并通過MegAlign、Mega11和RDP5軟件解析我國CaYSV病毒序列特征、遺傳進(jìn)化及重組事件,為該病毒的防控提供指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

美人蕉葉片樣品采自江蘇省揚(yáng)州市、湖南省長沙市,其癥狀表現(xiàn)為條紋狀花葉,采集后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取及病原分子鑒定

取美人蕉病葉100 mg,用液氮研磨,參照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明書提取RNA,溶解后于-80 ℃保存。以美人蕉總RNA為模板,利用M4T為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,再參照陳炯等[12]報(bào)道的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收、克隆后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果使用NCBI網(wǎng)站BLAST進(jìn)行比對(duì)。

1.3 CaYSV全基因組引物設(shè)計(jì)及RT-PCR擴(kuò)增

根據(jù)從GenBank下載的12個(gè)CaYSV全基因組序列設(shè)計(jì)引物(表1),并以CaYSV-3R為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到新cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。25 μL擴(kuò)增體系:10×Buffer(Mg2+plus)2.50 μL、2.50 mmol dNTP 1.00 μL、正反向引物各1.00 μL、cDNA 1.00 μL、DNA 聚合酶 0.25 μL、ddH2O 18.25 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。5′-race擴(kuò)增,分別設(shè)計(jì)5′-race引物CaYSV-in和CaYSV-out,具體實(shí)驗(yàn)操作參照Scotto-Lavino等的方法[13]。

表1 CaYSV擴(kuò)增引物

1.4 序列分析

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,用DNA凝膠回收試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)回收目的片段,克隆、測序后經(jīng)DNASTAR軟件拼接。通過MegAlign軟件Clustal W方法比對(duì)不同分離物全基因組核苷酸序列和多聚蛋白氨基酸序列的一致率。以BYMV和SCMV為外組,根據(jù)全基因組核苷酸序列和CP蛋白氨基酸序列分別通過Mega 11軟件利用極大似然法(Maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,Bootstrap檢驗(yàn)1000次[14]。

1.5 重組分析

利用RDP 5軟件包中RDP、GENECONV、Boot Scan、MaxChi、Chimaera、3Seq和SiScan 7個(gè)軟件對(duì)CaYSV全基因組序列進(jìn)行重組檢測[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 美人蕉疑似病樣的癥狀

在江蘇省揚(yáng)州市、湖南省長沙市采集感病美人蕉葉片,病株均表現(xiàn)出葉脈黃化、脈間條紋狀褪綠癥狀(圖1)。

2.2 CaYSV分子鑒定及全基因組克隆與結(jié)構(gòu)分析

提取江蘇揚(yáng)州和湖南長沙美人蕉病樣的總RNA,利用M4T引物分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,采用陳炯等[12]的方法進(jìn)行擴(kuò)增,獲得1.8 kb目的條帶,測序結(jié)果經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)揚(yáng)州和長沙美人蕉病樣分離物的序列與CaYSV分離物KS一致率最高,分別達(dá)99.3%和99.5%。

采用分段克隆和RACE方法對(duì)揚(yáng)州分離物和長沙分離物全基因組序列進(jìn)行克隆,分別獲得大小為3814、4119和1697 bp目的條帶和約330 bp RACE條帶。利用DNASTAR對(duì)所得片段進(jìn)行拼接,獲得CaYSV揚(yáng)州分離物和長沙分離物全基因序列,二者全基因組序列長度均為9501 nt,其中5’UTR均為153 nt,3’UTR均為225 nt(GenBank登錄號(hào)分別為OQ 627371和OQ 627372)。CaYSV全基因組包含1個(gè)9123 nt的開放閱讀框(Open reading fragment, ORF),編碼3040個(gè)氨基酸的多聚蛋白,通過水解酶酶切形成10個(gè)成熟蛋白,分別為P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP,其中NIb具有RdRp功能;9個(gè)酶切位點(diǎn)推定為Y/A、G/G、Q/K、Q/G、E/T、Q/A、E/G、E/D、Q/A,在P3中存在由G1A6移碼產(chǎn)生的PIPO蛋白(圖2)。

通過MegAlign軟件Clustal W比對(duì)不同分離物之間核苷酸和氨基酸一致率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaYSV揚(yáng)州分離物和長沙分離物與其他分離物全基因組核苷酸一致率分別在93.9%～99.4%和94.0%～99.5%,其中揚(yáng)州分離物與長沙分離物一致率最高,而長沙分離物與俄羅斯分離物KS一致率最高(圖3-a)。CaYSV揚(yáng)州分離物和長沙分離物與其他分離物多聚蛋白氨基酸一致率分別在95.1%～99.2%和95.7%～99.7%,揚(yáng)州分離物和長沙分離物均與俄羅斯分離物KS一致率最高(圖3-b)。

2.3 CaYSV系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 11中ML法,根據(jù)CaYSV全基因組核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。揚(yáng)州分離物(OQ627371-JSYZ)和長沙分離物(OQ627372-HNCS)關(guān)系最接近,與俄羅斯分離物KS(MG545919-KS)和貴州分離物GZ(OL546222-GZ)聚類到同一分支(圖4-a)。根據(jù)CaYSV的CP蛋白氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)CaYSV可以分為A和B 2個(gè)大組,其中A組又可以劃分為3個(gè)亞組,揚(yáng)州分離物和長沙分離物均聚類到A1亞組(圖4-b),說明揚(yáng)州分離物和長沙分離物與CaYSV分離物OK、KS、K2、PHC478遺傳關(guān)系較近。

2.4 CaYSVCP蛋白氨基酸序列分析

Ali和Mamoori等[20]研究發(fā)現(xiàn)CaYSV不同分組中絲氨酸和蘇氨酸存在不同的特征類型。對(duì)CaYSV CP蛋白N-端氨基酸進(jìn)行序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)揚(yáng)州分離物和長沙分離物第22、23、34、36、50位為絲氨酸,第2、26、29、35、58、60、65位為蘇氨酸(圖5)。其中基序S34TS36與A1亞組分離物OK、GZ、KS、DSMZ、K2-5-4一致,但與A1亞組K2-6-1、PHC478-6C6、PHC478-9C4的基序N34TS36不一致,說明揚(yáng)州分離物和長沙分離物CaYSV CP蛋白N-端絲氨酸和蘇氨酸變化與A1亞組基本一致,但A1亞組中也存在不同氨基酸的分化。

菱形表示本研究中獲得的分離物。The rhombus represents the isolate obtained in the study.

位點(diǎn)已標(biāo)記。The positions are pointed out.

2.5 CaYSV揚(yáng)州分離物和長沙分離物重組分析

通過RDP5軟件中的7個(gè)程序(RDP、GENECONV、Bootscan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq)對(duì)CaYSV揚(yáng)州分離物和長沙分離物進(jìn)行重組分析,發(fā)現(xiàn)RDP5軟件的7個(gè)程序均支撐CaYSV揚(yáng)州分離物和長沙分離物重組事件的發(fā)生,其中Chimaera算法的P值最大,為4.063×10-17(表2),主要親本序列均為分離物UK(GQ421689),說明CaYSV揚(yáng)州分離物和長沙分離物中均存在1個(gè)重組事件,重組位點(diǎn)分別為NIb(7891)和NIb(8015)。

表2 CaYSV揚(yáng)州分離物和長沙分離物重組事件分析

3 討 論

通過RT-PCR和RACE方法獲得病毒全基因組序列已在植物RNA病毒上廣泛應(yīng)用,利用該方法Tang等[16]獲得SCMV SO株系的全基因組序列,Imamura等[17]獲得火百合花葉病毒(Vallota mosaic virus, ValMV)的全基因組序列,王廿等[18]獲得草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)貴州分離物的全基因組序列,謝麗雪等[19]獲得東亞西番蓮病毒(East asian passiflora virus, EAPV)的全基因組序列。本研究采集江蘇揚(yáng)州和湖南長沙的美人蕉葉片樣品,獲得CaYSV病毒的揚(yáng)州分離物和長沙分離物的基因組全長序列。序列比對(duì)結(jié)果表明,揚(yáng)州分離物與長沙分離物一致率最高為99.4%,而長沙分離物與俄羅斯KS分離物一致率最高為99.5%。根據(jù)CP蛋白氨基酸序列將CaYSV分為A和B 2個(gè)組,其中A組可分為3個(gè)亞組,A1亞組主要包含美洲和東亞及東南亞地區(qū)分離物,A2亞組為美國NC1～NC5分離物,A3亞組為中東伊拉克分離物,B組為美國和歐洲分離物,上述結(jié)果與Chauhan等、Ali等報(bào)道一致[1,20],說明不同分組可能具有地域性,中國分離物與鄰近國家分離物的親緣關(guān)系較近。

CP蛋白作為病毒的組成蛋白,受到更多的自然選擇壓力,導(dǎo)致CP蛋白氨基酸序列發(fā)生改變。如辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)CP蛋白氨基酸變化克服辣椒L4基因型的抗性[21],SCMV玉米分離物和甘蔗分離物CP蛋白氨基酸的變化具有寄主依賴性[22]。CaYSV的CP蛋白共有287個(gè)氨基酸組成,其N端絲氨酸和蘇氨酸的變化有助于該病毒組和亞組的劃分[1]。揚(yáng)州分離物和長沙分離物CaYSV CP蛋白N-端絲氨酸和蘇氨酸變化與A1組基本一致。

重組是推動(dòng)RNA病毒變異進(jìn)化的主要?jiǎng)恿χ?在多種馬鈴薯Y病毒屬病毒中均有發(fā)現(xiàn)[23],在對(duì)煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)[24]、甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)[25]、油桃莖痘相關(guān)病毒(Nectarine stem-pitting-associated virus, NSPaV)[26]等病毒重組研究印證這點(diǎn)。前期發(fā)現(xiàn)CaYSV美國分離物BZ2、BZ3和OK存在重組事件[27],本研究發(fā)現(xiàn),CaYMV中國江蘇揚(yáng)州和長沙分離物也均存在重組事件,重組位點(diǎn)分別為NIb(7891)和NIb(8015),而該重組位點(diǎn)在英國分離物UK中也有報(bào)道[27]。

4 結(jié) 論

CaYSV存在于我國江蘇揚(yáng)州和湖南長沙的美人蕉上。根據(jù)CaYSV的CP蛋白氨基酸構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,揚(yáng)州分離物和長沙分離物聚類到A1亞組,與泰國分離物K2、PHC478及俄羅斯分離物KS等親緣關(guān)系較近。這為開展CaYSV的遺傳進(jìn)化、致病機(jī)制及其防控措施研究奠定基礎(chǔ)。