柏 松,張 冰,林先玉,屈 燕

(西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院/國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心,昆明 650224)

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為野生云南山茶1年生實生苗,種子采自四川省鹽邊縣格桑拉園藝場(101°35′96″E、27°08′76″N,海拔2445 m),播種于18 cm×13 cm×16 cm的塑料盆中,生長環(huán)境為西南林業(yè)大學(xué)后山樹木園溫室大棚。選取的云南山茶幼苗長勢一致,生長狀況良好且無病蟲害。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 將苗木放置于25 ℃、濕度70%的人工氣候培養(yǎng)箱中緩苗7 d,每天7:00—19:00光照強度為4000 Lux,其余時間關(guān)閉光照系統(tǒng)。緩苗7 d后將溫度設(shè)置為40 ℃,其他條件不變。將0 h的試驗材料作為對照,40 ℃的試驗材料作為高溫處理組。

在高溫處理0、24、72、re48 h(恢復(fù)48 h)、re72 h(恢復(fù)72 h)后,對試驗材料進行隨機取樣,每個時間點取3個重復(fù),所取葉片洗凈剪碎混勻后,用錫箔紙迅速包裹好,放置于液氮中速凍,后裝于填寫有樣品信息的塑封袋中,然后放置于超低溫-80 ℃冰箱中保存待用,用于測定各項生理指標和轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2 生理指標的測定 生理指標的測定方法均參照李合生[12]的試驗方法:丙二醛(MDA)活性采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法測定,超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定,過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定,過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序 預(yù)試驗發(fā)現(xiàn),云南山茶在40 ℃的高溫脅迫下,抗氧化酶活性會發(fā)生顯著變化,且在0、24、72和re48 h抗氧化酶的變化顯著,故選擇云南山茶在40 ℃脅迫下的0、24、72、re48 h 4個時間節(jié)點進行轉(zhuǎn)錄組測序,每組3個重復(fù)共21個樣品,由武漢邁維生物科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

Illumina測序平臺測序后獲得Raw data,使用fastp軟件對Raw data過濾、篩選、檢查后獲得clean reads,然后用Trinity軟件拼接Clean reads、Corset層次聚類后獲得Unigene,隨之將Unigene分別與KEGG、NR、Swiss-Prot、GO、KOG等數(shù)據(jù)庫進行比對,獲得注釋信息,之后使用DESeq2進行樣品差異表達分析,獲得差異表達基因集;以“|log2Fold Change|≥1,且FDR<0.05”為標準篩選差異基因。最后統(tǒng)計不同時間點處理組中的差異表達基因,并對其進行注釋和富集分析。

從差異基因中篩選出被KEGG注釋到的抗氧化酶基因,分析其所在的KEGG通路,對這些基因的表達量進行聚類分析,篩選出與抗氧化酶活性變化規(guī)律一致的基因,并進一步對篩選出的基因與抗氧化酶活性進行相關(guān)性分析。

Total RNA提取采用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取(DP441)試劑盒;cDNA合成采用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒;qRT-PCR引文設(shè)計使用軟件Premier Premier 6.0(引物序列見表1),熒光定量儀器為LightCycler480實時熒光定量PCR儀,使用擎科生物2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)反應(yīng)體系,程序設(shè)定為95 ℃/2 min;95 ℃/30 s,56 ℃/15 s,72 ℃/30 s,35個循環(huán),以Actin基因為內(nèi)參基因,表達量計算采用2-ΔΔCt法。

表1 qRT-PCR 驗證差異表達基因引物序列

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Microsoft Excel 2017記錄統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù);采用R語言軟件(4.1.3版本)對抗氧化酶活性進行多重比較并繪制柱形圖,對抗氧化酶基因進行聚類分析并繪制熱圖和聚類趨勢圖,對抗氧化酶與相關(guān)基因進行Pearson相關(guān)性的顯著性檢驗并繪制相關(guān)性圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對云南山茶丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性的影響

如圖1-A所示,隨著高溫處理的進行,MDA含量在高溫脅迫24 h時,比0 h顯著降低(P<0.05),在脅迫72 h時,MDA含量維持著相對較低的水平,在re48 h時,MDA含量顯著上升(P<0.05),在re72 h時,MDA含量到達最高值,為22.65 mmol/g。

如圖1-B所示,云南山茶葉片的POD活性在40 ℃高溫脅迫下呈先上升后下降,在恢復(fù)期間呈顯著上升趨勢(P<0.05)。72 h時,POD活性最低,而re72 h時,POD活性達到最高,為83.33 U/(g·min);如圖1-C所示,SOD活性高溫脅迫24 h比0 h時顯著升高(P<0.05),呈先上升后下降趨勢,并且在re48 h時達到最大值,為2676.76 U/(g·h);如圖1-D所示,與0 h時相比,CAT活性在脅迫24 h時呈較低水平,并且顯著低于0 h時,在高溫脅迫至72 h時,CAT活性大幅上升,在re48 h時,CAT活性顯著降低,而在re72 h時,CAT活性顯著升高(P<0.05),達到最高水平,為12.78 U/(g·min)。

不同小寫字母表示同一指標不同時間點差異顯著(P<0.05)。Different lowercases indicate significant differences for the same indicator at different time points(P<0.05).

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析及熒光定量驗證

經(jīng)過組裝過濾得到的高質(zhì)量reads的堿基數(shù)為150.84 Gb,GC比例為43.97%～45.10%,堿基組成均衡。各樣品堿基質(zhì)量值達到Q20以上水平的堿基數(shù)目占比均大于97%,達到Q30以上水平的占比均大于94%,說明各樣品測序質(zhì)量高。

隨機選取9個基因進行q-PCR驗證,9個基因的表達趨勢與RNA-seq結(jié)果一致,表明RNA-seq結(jié)果可信度較高。

2.3 抗氧化酶差異基因篩選

通過KEGG功能注釋對Unigene進行初步篩選,在40 ℃脅迫下,與0 h時對比, 24 h時與POD相關(guān)的差異基因有49條,其中下調(diào)表達有35條,上調(diào)表達有14條, 72 h時與POD相關(guān)的差異基因有60條,其中26條下調(diào)表達,34條上調(diào)表達;24 h時與SOD相關(guān)的差異基因有19條,其中下調(diào)表達有8條,上調(diào)表達有11條,72 h時與SOD相關(guān)的差異基因有13條,其中下調(diào)表達有7條,上調(diào)表達有6條;24 h時與CAT相關(guān)的差異基因有10條,其中下調(diào)表達有9條,上調(diào)表達有1條,72 h時與CAT相關(guān)的差異基因有9條,其中下調(diào)表達有8條,上調(diào)表達有1條。

2.4 抗氧化酶相關(guān)基因相對表達量變化規(guī)律

2.4.1 POD相關(guān)基因 云南山茶在40 ℃高溫脅迫下,篩選出POD相關(guān)的基因76條。如圖2所示,聚類熱圖結(jié)果將基因劃分為8個類型(Cluster 1,Cluster 2,Cluster 3,……Cluster 8)。Cluster 8中基因表達量變化趨勢和POD活性的變化趨勢相同(圖1-B,圖2);而Cluster 2中基因的表達量變化趨勢與POD活性的變化趨勢相反。通過表2相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),Cluster 8中CrPOD51的表達量與POD活性存在極顯著強正相關(guān)(P<0.01,r=0.727),Cluster 2中CrPOD2等27條基因與POD活性呈極顯著強負相關(guān)(P<0.01,|r|>0.8),4條基因呈顯著強負相關(guān)(0.010.8)。

2.4.2 SOD相關(guān)基因 如圖3所示,22條與SOD相關(guān)的基因根據(jù)聚類結(jié)果可大致分為4個類型(Cluster 1,Cluster 2,……Cluster 4),Cluster 1包含CrSOD1等5條基因,在24 h時均上調(diào)表達,在re48 h時下調(diào)表達,變化趨勢與SOD活性變化趨勢一致(圖1-C,圖3);類型4包含CrSOD5等8條基因,在24 h時下調(diào)表達,在re48 h時上調(diào)表達,變化趨勢與SOD活性變化趨勢相反。如表3所示,將Cluster 1和Cluster 4中的基因與SOD活性進行相關(guān)性分析,CrSOD10與SOD活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01,r=0.71),CrSOD20與SOD活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01,r=0.9),CrSOD17與SOD活性呈顯著負相關(guān)(P<0.05,r=-0.67)。

0h-1,0h-2,0h-3……re48h-3,表示從0 h至re48 h不同時間點的不同樣本;Cluster 1,Cluster 2,……Cluster 8 表示根據(jù)基因表達量變化趨勢分類的不同類別。彩色熱圖表示相關(guān)基因在不同時期的相對表達量,從紅色到藍色表示相對表達量從高到低。下同。0h-1,0h-2,0h-3...... re48h-3 represent different samples at different time points from 0 h to re48 h; Cluster 1, Cluster 2,...... Cluster 8 represents different groups classified according to trends in gene expression.The color heat map represents the relative expression levels of related genes at different times, and the relative expression levels from red to blue indicate from high to low. The same as below.

表2 相關(guān)基因與POD活性的相關(guān)性分析

圖3 SOD相關(guān)基因表達熱圖及聚類趨勢圖Fig.3 Heat map and cluster trend map of SOD-related gene expression

表3 相關(guān)基因與SOD活性的相關(guān)性分析

2.4.3 CAT相關(guān)基因 云南山茶在40 ℃的高溫處理下,篩選與CAT相關(guān)的基因10條。如圖4所示,Cluster 1包含CrCAT1等9條基因,在24 h時下調(diào)表達,在re48 h時上調(diào)表達;CrCAT9基因在24 h時上調(diào)表達,在72 h時和re48 h時均下調(diào)表達。在這些基因當中,未發(fā)現(xiàn)與CAT酶活性變化規(guī)律一致的基因。

圖4 CAT相關(guān)基因表達熱圖及聚類趨勢圖Fig.4 Heatmap and cluster trend map of CAT-related gene expression

3 討 論

高溫脅迫下,植物會通過提高抗氧化酶活性來抵御高溫脅迫對植株產(chǎn)生危害[13-18]。本研究中,云南山茶在高溫脅迫下抗氧化酶活性總體呈升高趨勢。高溫處理過程中,云南山茶通過增強SOD活性清除活性氧,對高溫脅迫做出響應(yīng)。POD活性和CAT活性在高溫脅迫期間分別在24和72 h時顯著上升,兩者協(xié)調(diào)發(fā)揮作用,清除云南山茶體內(nèi)過多的H2O2,這與傅巧娟等[18]研究的高溫脅迫下帝王等品種的一串紅抗氧化酶活性的變化趨勢相同。

對基因富集的KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),SOD和CAT的差異基因主要集中于過氧化物酶體通路中。在過氧化物酶體中,活性氧的穩(wěn)態(tài)很大程度上通過清除系統(tǒng)調(diào)節(jié)[19]。非生物脅迫過程中,過氧化物酶體通過靶向信號(PTS)指引核基因編碼的酶分子前體進入體內(nèi),從而合成過氧化氫酶、脂肪酸β-氧化酶等酶[20]。高溫脅迫可能會刺激云南山茶體內(nèi)定位信號PTS1產(chǎn)生,指引合成SOD、CAT分子前體,然后轉(zhuǎn)運到過氧化氫酶體,促進SOD、CAT基因上調(diào)表達,從而提高SOD、CAT含量及其表達活性,進而清除活性氧,這與朱晨璐等[11]的研究結(jié)果一致。POD相關(guān)的差異基因主要集中在苯丙烷生物合成通路中,POD參與木制素的合成過程,對于植物抵御非生物脅迫有重要意義[21]。在高溫脅迫下,云南山茶POD相關(guān)基因表達量上調(diào),參與合成木質(zhì)素,增強云南山茶對高溫的抵御能力。這與尹麗興[22]的研究結(jié)果一致。

非生物脅迫會引起植物體內(nèi)抗氧化酶相關(guān)基因發(fā)生變化,從而調(diào)控抗氧化酶SOD、POD、CAT含量及其表達活性,抵御高溫脅迫對植物體的危害[23-24]。本研究中,在高溫脅迫期間,CrPOD51、CrSOD10等基因表達量上調(diào),調(diào)控POD和SOD活性上升,在后續(xù)試驗過程中與POD和SOD活性變化趨勢保持一致,并有著顯著相關(guān)性。對突變體雜交組合水稻在高溫下抗氧化酶基因的研究發(fā)現(xiàn),CAT和POD相關(guān)基因的表達量呈上下波動趨勢,本研究中的CrPOD51等基因有相同的情況,從分子角度尋找抗氧化酶基因表達量降低的原因有待于進一步研究[25]。本研究未發(fā)現(xiàn)與CAT活性變化規(guī)律一致的CAT相關(guān)基因,但CrCAT9基因在脅迫期間表達量上調(diào)。此外,還有部分抗氧化酶基因表達量的變化趨勢和SOD、POD活性變化趨勢相反且顯著負相關(guān),CAT大部分基因在脅迫期間表達量下調(diào),這部分基因是否參與了抗氧化酶的調(diào)節(jié)過程還有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

40 ℃高溫脅迫下,云南山茶能夠通過提高POD、SOD、CAT活性來抵御高溫脅迫,CrSOD1、CrSOD10等基因在SOD活性調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用,CrPOD51、CrPOD58等基因則與POD活性有關(guān)。這些基因可能在云南山茶遭受高溫脅迫時發(fā)揮重要作用。