唐 婕,黃斌翰,李文杰,周嘉裕,廖 海

(西南交通大學生命科學與工程學院,成都 610031)

【研究意義】蛋白酶參與生物體內多種生理生化過程,如新陳代謝、細胞周期、細胞凋亡等,對其活性的精準調控是維持正常生命活動的關鍵。生物體可以通過激活蛋白的內源性抑制劑對其活性進行調控[1]。植物中含有大量的抑制劑[2],它們以類似底物的方式與酶的活性部位緊密結合,形成穩(wěn)定的復合體,從而達到調控蛋白酶活性的效果。自從1946年庫尼茨(Kunitz)發(fā)現(xiàn)大豆胰蛋白酶抑制劑以來,已經從不同的豆科植物中分離出許多蛋白酶抑制劑,已有一部分研究對這些蛋白酶抑制劑的營養(yǎng)價值進行了介紹[3],但關于它們發(fā)揮生理作用的確切機制研究較少[4]。蛋白酶抑制劑傳統(tǒng)上被歸類為半胱氨酸抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑。Kunitz蛋白酶抑制劑(Kunitz trypsin inhibitor,KTI)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的胰蛋白酶抑制劑。KTI是一類天然的小分子蛋白,其分子量通常在18～24 kDa,常見于含羞草亞科、蘇木亞科和鳳蝶亞科的貯藏組織,如果實、塊莖和種子中,對維系生物體的正常生命活動具有重要作用,主要可以抑制絲氨酸蛋白酶的活性。依據(jù)肽鏈及二硫鍵的數(shù)量差異,KTI被分為6個亞類型[5]。KTI通常含有一個或多個串聯(lián)的Kunitz結構域,通過與靶酶形成抑制劑-靶酶復合物,從而抑制靶酶的活性。KTI家族成員的三維結構在植物中高度保守,形成β-三葉草(β-trefoil)型結構,由位于中央的疏水核心骨架與位于外圍的親水Loop環(huán)構成。疏水核心骨架包括12個反向平行β-折疊,其中6個反向平行β-折疊形成骨架底部的β-桶(β-barrel),其余6個反向平行β-折疊形成骨架頂部的蓋子(Lid)。該骨架結構中含有較多疏水性氨基酸,彼此通過氫鍵等次級鍵與相鄰的氨基酸相互作用,參與骨架結構的組裝與穩(wěn)定。因此,研究這些氨基酸的功能不僅有利于確定β-三葉草結構形成的分子機制,也對KTI結構的深入研究具有重要指導意義。【前人研究進展】KTI具有抗蟲、抗菌、抗病毒、抗腫瘤轉移和遷徙、炎癥調節(jié)以及抗非生物脅迫等多種生物學活性。例如,Dunse等[6]將轉入馬鈴薯I型和II型絲氨酸蛋白酶抑制劑的棉花飼養(yǎng)棉鈴蟲11 d后,發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲的生長出現(xiàn)停滯,喂食含有2種絲氨酸蛋白酶抑制劑的幼蟲重量比沒有喂食抑制劑的對照幼蟲輕40%,且長度比對照幼蟲短90%,證明KTI的抗蟲能力;Ramalho等[7]從雅致寬足豆(Platypodiumelegans)的種子中分離得到一種Kunitz蛋白酶抑制劑(PeTI),其對草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的中腸類胰蛋白酶具有抑制作用。喂食含有PeTI的人工飼料后,草地貪夜蛾的生長發(fā)育與生物量積累出現(xiàn)明顯的阻滯,從而為草地貪夜蛾的生物防治與基因工程育種篩選到1個較好的候選抗蟲因子;Lopes等[8]研究發(fā)現(xiàn),在長期的進化過程中,包括KTI在內的蛋白酶抑制劑與昆蟲消化酶相互對抗并在沖突中產生進化的推動力,增加了植物蛋白酶抑制劑的多樣性,因此,研究蛋白酶抑制劑有助于深入理解物種進化與環(huán)境適應的基本原理;Zhu等[9]研究發(fā)現(xiàn),當茶樹(Camelliasinensis)感染炭疽病菌或受到茶尺蠖咬食后,KTI基因的表達會顯著增加,并集中分布于葉及鄰近組織,表明KTI是茶樹防御體系的成員之一,保護茶樹免受炭疽病菌或茶尺蠖的傷害,證明KTI的抗蟲和抗菌能力;Fang等[10]從韓國大黑豆中純化出分子量為20 kDa的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑,檢測得到其半抑制濃度 (IC50)值為 0.71 μmol/L,而對照組62 kDa的斑豆凝集素IC50值為2.2 μmol/L,說明KTI能夠抑制HIV-1的反轉錄酶活性,證明KTI的抗病毒作用;Clemente等[2]對來自大豆的Bowman-Birk抑制劑(Bowman-Birk inhibitors,BBI)進行重組后得到rTI1B,用rTI1B處理HT29人結腸腺癌細胞和非惡性結腸成纖維細胞CCD-18Co細胞,發(fā)現(xiàn)rTI1B處理濃度越高,HT29人結腸腺癌細胞的生長越緩慢,而對照組CCD-18Co細胞則沒有受到rTI1B處理濃度的影響。當對rTI1B的關鍵活性位點突變后,用突變體再次處理HT29細胞,發(fā)現(xiàn)HT29細胞的生長沒有顯著變化。這些發(fā)現(xiàn)表明,BBI和相關蛋白可以作為研究癌變早期階段潛在的化學預防作用的分子靶點;近期有報道稱KTI基因還能夠提高植物抵抗非生物脅迫的能力。例如,Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn),將野生大豆(Glycinesoja)來源的KTI基因在擬南芥中過表達,能夠改善植物的抗旱能力,具體體現(xiàn)為缺水21 d后,80%轉基因植物能夠存活,而相同條件下,僅有5%的野生型植物能夠存活;Yu等[12]從川產道地中藥川芎 (Ligusticumchuanxiong)中分離出一個具有Kunitz結構域的α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑基因,該基因的mRNA含量在鹽、低溫與干旱脅迫下明顯增加,表明其在響應非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】西南交通大學生命科學與工程學院藥用植物與分子生物學實驗室在前期研究中,從豆科決明屬植物決明(Cassiaobtusifolia)中分離得到決明Kunitz蛋白酶抑制劑1(CassiaobtusifoliaKunitz trypsin inhibitor,CoTI1)基因,其重組蛋白對胰蛋白酶等絲氨酸類蛋白酶具有較強的抑制活性[13]。比較CoTI1與其它物種來源的KTI,發(fā)現(xiàn)它們均含有保守的Cys44、Tyr134和Lys135殘基,分析這3個殘基在CoTI1三維結構中可能發(fā)揮的作用,然后再利用定點突變進行驗證?！緮M解決的關鍵問題】基于CoTI1的結構分析,探究定點突變對其抑制活性的影響,進一步為CoTI1的結構研究及后續(xù)改造提供堅實的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)購自上海生工生物工程(成都)有限公司,CoTI1-pET28a表達載體由西南交通大學生命科學與工程學院藥用植物與分子生物學實驗室前期構建保存;定點突變試劑盒Mut Express II Fast Mutagen-esis Kit V2購自南京諾唯贊公司;N-苯甲?；?DL-精氨酸-硝基苯胺(N-Benzoyl-DL-arginine-pnitroaniline,BAPNA)購自Sigma公司;質粒抽提試劑盒Omega Plasmid Mini Kit I和膠回收試劑盒Gel Extraction Kit購自OMEGA公司;異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)購自MEKER公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司;卡那霉素(Kanamycin,Kana)購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1CoTI1基因的定點突變 定點突變采用一步法[14]原理,根據(jù)Cys44、Tyr134和Lys135在CoTI1-pET28a中對應的核苷酸序列設計突變引物(表1),通過PCR將TGC(Cys44)、TAC(Tyr134)和AAG(Lys135)分別突變成GCC(Ala)、GCC(Ala)和GCG(Ala)。

表1 本研究所用引物

PCR反應體系如表2所示,PCR反應條件為95 ℃預變性30 s; 95 ℃變性10 s,Cys44、Tyr134和Lys135分別用70、66和68 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s(30個循環(huán)); 最后再72 ℃延伸5 min,于4 ℃保存。

表2 PCR反應體系

PCR產物經DpnI消化去除甲基化模板質粒后,再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收消化產物,將消化后產物用ExnaseII催化,使突變位點高效重組,實現(xiàn)DNA的體外環(huán)化。將重組產物轉化DH5α,37 ℃過夜培養(yǎng),測序確認重組產物,再提取正確突變質粒,將其轉入BL21(DE3)進行表達。

1.2.2 突變體的表達、活性檢測及菜青蟲類胰蛋白酶提取 將突變體CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1K135D菌液以1∶100的比例轉接入含Kanamycin的液體LB培養(yǎng)基[15],在37 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)至OD600(光密度值)為0.6后,加入工作濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG),在26 ℃、140 r/min的條件下誘導表達12 h。收集菌體進行超聲破碎,離心后取上清加入Ni2+柱4 ℃結合1 h,棄掉上清,再用200 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫得到突變體,最后對突變體進行透析過夜得到純化后突變體[16]。純化后突變體用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測其濃度,再放入-80 ℃保存。突變體的活性檢測[17]采用N-苯甲酰基-DL-精氨酸-硝基苯胺(BAPNA)為反應底物,CoTI1與胰蛋白酶相互作用產生黃色的對硝基苯胺,可在410 nm波長下檢測到吸光值。

取4～5齡的菜青蟲于預冷研缽中,用液氮研磨成粉末后加入1 mL的150 mmol/L NaCl生理鹽水,在4 ℃條件下抽提蛋白15 min后,12 000 r/min,4 ℃離心15 min,所得上清液即為菜青蟲類胰蛋白酶液,測定濃度后保存于-80 ℃?zhèn)溆肹17]。

2 結果與分析

2.1 突變位點的確定

CoTI1的三維結構由12個反向平行的β-折疊和13個loop環(huán)組成[18],含有2個二硫鍵(Cys44-Cys89和Cys139-Cys147),活性基序為L64-V65-R66-P67-T68。β-三葉草骨架結構包括12個反向平行β-折疊,其中6個反向平行β-折疊形成骨架底部的β-桶(β-barrel),其余6個反向平行β-折疊形成骨架頂部的蓋子(Lid)。Loop環(huán)可能是通過插入到靶蛋白酶的底物口袋中而發(fā)揮抑制作用。Cys44殘基位于頂部蓋子,Tyr134和Lys135殘基位于底部桶內。通過與其他植物KTI序列(BvTI[19]、WBTI-2[20]、STI[21]、ILTI[22]、DrTI[23]、KTI5[24])比較可以看出,Cys44、Tyr134和Lys135殘基在其他KTI中也高度保守(圖1)。

通過分析CoTI1的Cys44、Tyr134和Lys135可知,Cys44位于β2和β3折疊之間,與Ile36形成氫鍵,與Cys89形成氫鍵和二硫鍵。Tyr134位于β9折疊,與Leu172形成氫鍵。Tyr135位于β9折疊,與Lys125和Asn149形成氫鍵。Cys44、Tyr134和Lys135通過與其他殘基形成氫鍵或二硫鍵,參與三葉草骨架結構的形成并決定結構的穩(wěn)定性(圖2)。

2.2 CoTI1定點突變株的獲取

本研究采用一步法,PCR擴增獲得3個突變體(約為5900 bp),電泳結果(圖3)初步表明突變成功。由測序結果(圖4)可知,原始序列由TGC(Cys44)、TAC(Tyr134)和AAG(Lys135)分別突變成GCC(Ala)、GCC(Ala)和GCG(Ala),隨后提取正確突變的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)得到突變體CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1K135D的表達菌株。

2.3 突變體蛋白的表達與純化

各取3 mL CoTI1、突變體CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1K135D的菌液轉接到300 mL的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6后,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG在26 ℃、140 r/min條件下誘導表達12 h,電泳結果(圖5)顯示,CoTI1和3個突變體均表達成功,分子量約為24 kDa。

2.4 野生型和突變體蛋白的活性檢測

為驗證序列比對的3個保守殘基(Cys44、Tyr134和Lys135)的作用,分別將這3個保守殘基突變成Ala。將CoTI1、CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1K135D同時進行蛋白表達純化和活性檢測,蛋白濃度用BCA試劑盒檢測,蛋白抑制活性用Erlanger法測定。結果顯示, CoTI1對牛胰蛋白酶和菜青蟲類胰蛋白酶均有較顯著的抑制活性(圖6),當CoTI1用量為80 μg時,其對牛胰蛋白酶和菜青蟲類胰蛋白酶的抑制活性分別達94.52%和94.17%。

圖1 CoTI1與其他KTIs多序列比對Fig.1 Multi-sequence alignment of CoTI1 and other KTIs

圖2 Cys44(a)、Tyr134(b)和Lys135(c)的相互作用網絡Fig.2 Interaction network of Cys44(a),Tyr134(b) and Lys135(c)

1～3分別代表CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1K135D。1-3 indicate CoTI1C44D, CoTI1Y134D and CoTI1K135D, respectively.

圖4 CoTI1、CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1K135D的測序結果Fig.4 The sequencing results of CoTI1,CoTI1C44D,CoTI1Y134D and CoTI1K135D

CoTI1C44D對牛胰蛋白酶的抑制活性顯著高于CoTI1,當CoTI1和CoTI1C44D用量均為40 μg時,CoTI1C44D對牛胰蛋白酶的抑制活性比CoTI1高41%(P<0.001),說明該Cys44殘基的二硫鍵和氫鍵斷裂之后更有利于CoTI1與牛胰蛋白酶結合(圖7)。CoTI1Y134D和CoTI1K135D對牛胰蛋白酶的抑制活性顯著低于CoTI1(P<0.001),當CoTI1、CoTI1Y134D和CoTI1K135D用量均為80 μg時,CoTI1Y134D和CoTI1K135D對牛胰蛋白酶的抑制活性分別比CoTI1低45.66%和36.73%,說明Tyr134和Lys135殘基對于提高CoTI1與胰蛋白酶的結合具有重要意義。

1～4分別代表CoTI1、CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1k135D。1-4 indicate CoTI1, CoTI1C44D, CoTI1Y134D and CoTI1K135D, respectively.

*、**和***分別代表P<0.05、P<0.01、P<0.001。*, **and *** indicate P<0.05, P<0.01 and P<0.001, respectively.

相較于CoTI1,CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1K135D對菜青蟲類胰蛋白酶的抑制活性均有不同程度的減弱,其中CoTI1Y134D最顯著(P<0.001)。當用量為80 μg時,CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1K135D對菜青蟲類胰蛋白酶的抑制活性分別較CoTI1低46.94%、49.00%和38.11%(圖8)。說明Cys44、Tyr134和Lys135對于增強CoTI1與菜青蟲類胰蛋白酶的結合均起到了重要作用。

圖7 不同濃度CoTI1、CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1K135D對牛胰蛋白酶的抑制活性Fig.7 The inhibition essays of different concentrations of CoTI1,CoTI1C44D,CoTI1Y134D and CoTI1K135D to bovine trypsin

3 討 論

大多數(shù)KTI在單鏈或雙鏈多肽中有4個保守的半胱氨酸殘基,形成2個二硫鍵。Oliva等[5]依據(jù)肽鏈及二硫鍵的數(shù)量差異將KTI分為6個亞家族,CoTI1具有1條肽鏈和2對二硫鍵,屬于IV型亞家族。通常認為位于抑制活性環(huán)兩側的2個Cys殘基(CoTI1中的Cys44與Cys89)保守性較強,兩者間形成的二硫鍵有助于支撐抑制活性環(huán)的空間位置;而位于下游的2個Cys殘基(CoTI1中的Cys139與Cys147)保守性較差,例如豆科鐵木豆屬植物(Swartziapickellii)[25]的KTI中僅含有2個保守性較強的Cys殘基。本研究通過序列比對發(fā)現(xiàn),Cys44在KTI中高度保守,位于頂部蓋子的β2和β3折疊之間,與Cys89形成二硫鍵和氫鍵,與Ile36形成氫鍵。當Cys44突變后,突變體對牛胰蛋白酶的抑制活性提高41%,推測盡管Cys44和Cys89之間的二硫鍵發(fā)生斷裂,但氨基酸殘基間仍能夠通過氫鍵形成正常的折疊,維持抑制活性環(huán)的空間位置,甚至更為突出,有利于與牛胰蛋白酶結合,提高抑制活性。例如紫荊花Kunitz蛋白酶抑制劑(BauhiniaKunitz-type proteinase inhibitorsr,BbKI)不含二硫鍵,但其結構穩(wěn)定性和生物學功能由氫鍵維持[26]。與此同時,本研究觀察到CoTI1C44D突變體對菜青蟲類胰蛋白酶的抑制活性下降46.94%,可能是因為菜青蟲在進化過程中其原始的類胰蛋白酶底物口袋里的某些氨基酸殘基發(fā)生了突變,使其對KTI的敏感性下降,產生了抗性。

圖8 不同濃度CoTI1、CoTI1C44D、CoTI1Y134D和CoTI1K135D對菜青蟲類胰蛋白酶的抑制活性Fig.8 The inhibition essays of different concentrations of CoTI1,CoTI1C44D,CoTI1Y134D and CoTI1K135D to cabbage worm trypsin-like protease

盡管各KTI氨基酸序列相似度僅有43%,但它們均具有共同的β-三葉草型的三級結構。β折疊在該三級結構中扮演重要角色,其形成了內部的疏水核心,支撐起三維整體結構。通過序列比對發(fā)現(xiàn),Tyr134與Lys135在KTI中高度保守,位于底部β-桶的β9折疊中,Tyr134與Leu172形成氫鍵,Lys135與Lys125和Asn149形成氫鍵。Tyr134與Lys135發(fā)生突變后,分別對牛胰蛋白酶降低45.66%和36.73%的抑制活力,對菜青蟲類胰蛋白酶降低49.04%和38.11%的抑制活力。說明這2個氨基酸在維持三級結構的過程中發(fā)揮了重要作用,推測突變后,原有的氫鍵被打斷,可能導致折疊疏水核心的崩塌,并最終引起抑制活性的降低。該區(qū)域其它位點的氨基酸殘基也具有類似作用,例如Majumder等[27]分析大豆Kunitz抑制劑(STI)的晶體結構,發(fā)現(xiàn)Trp91殘基位于底部β-桶與頂部蓋子的連接處,其突變后突變體內部出現(xiàn)較大空隙,蛋白結構塌陷,抑制活性明顯下降。然而在Ravichandran等[28]的研究中,位于β-桶的Asn14氨基酸突變之后盡管其典型的構象保持完整,但其對同源酶的抑制親和活性提高了2倍。表明β-桶的構建較為復雜,參與β-三葉草型構成的關鍵氨基酸還需進一步研究。

4 結 論

Cys44、Tyr134和Lys135 3個位點突變后對牛胰蛋白酶和青蟲類胰蛋白酶的抑制活性發(fā)生了較大改變,說明它們參與了β-三葉草結構的形成,是穩(wěn)定CoTI1的空間結構及抑制活性的重要殘基,但關于β-桶的結構研究仍需進一步深入。以上結果為CoTI1的結構功能相關研究提供了理論支持。